本文是一篇医学论文，本实验对辐状肋柱花进行了化学成分分析及其对肿瘤细胞的抑制活性评价，这一系列实验在一定程度上为今后开发利用蒙药辐状肋柱花奠定了基础数据。本课题只对辐状肋柱花石油醚提取部分进行了研究，对于化学成分的分析还不够全面，因此，对辐状肋柱花的化学成分还需要继续对乙酸乙酯和正丁醇提取部分进行分析工作。
第一章 绪论
1.1 肿瘤
机体在外界刺激因素下，局部组织细胞的过度增生所形成的肿块被称为肿瘤。根据肿瘤的分化程度和生长速度可分为良性和恶性，良性肿瘤细胞生长缓慢不会转移，而恶性肿瘤细胞会以较快的生长速度转移到全身各个组织。近年来，无论是我国还是世界许多国家，越来越多的人因恶性肿瘤逝世，导致人类的生命和健康严重受到影响。通过放射治疗、化疗药物治疗、手术治疗等多种方法可以有效的抑制肿瘤细胞在体内生长，也可以提高患者的寿命和生活水平，但都存在着一些缺陷。如放射治疗、化疗药物治疗在临床上难免药物毒性大造成的正常组织损伤，手术治疗带来的并发症有可能导致患者死亡[1]。因此，肿瘤是病因、临床表现及治疗比较复杂的一类疾病，所以彻底征服肿瘤疾病是一项艰难的任务。如今，具有悠久历史的传统中药在抗肿瘤方面具有依赖性小及毒副作用低的优点，吸引了国内外越来越多的研究者的目光，抗肿瘤中药研发有望成为研究的热点[2]。
中药在我国使用已有数千年历史，伴随着整个中国文明的发展，在中医学理论中，恶性肿瘤的形成、生长和机体当中分化的整个过程，是人体内正邪斗争的过程，因为机体中的正气亏虚使得邪气在机体当中滞留，就会导致机体发生病变 [3]。中药治疗肿瘤的方法不像西医直接利用技术手段作用于肿瘤部位，虽然西医可以短时间内消除恶性肿瘤，可以使患者康复，但是不可忽略第二次复发的风险，而中药治疗恶性肿瘤是可以缓解治疗过程中的不良反应，提高免疫力，适当延长寿命，并且可以通过调节多种机制，全方位、多靶点起抗肿瘤作用，减少产生耐药性 [4]。
随着现代科学技术发展，越来越多的科研人员从各种各样的中药中发现了天然抗肿瘤活性物质，并且在恶性肿瘤的临床治疗上提供了显著贡献，天然化合物修饰得到的衍生物也同样具有良好的抗肿瘤活性，在治疗恶性肿瘤方面提供了更多的选择，而且有毒副作用小的优点。因此，开发具有抗肿瘤活性的天然药物对临床应用具有重大意义。
1.2 辐状肋柱花的植物概况
辐状肋柱花 [Lomatogonium rotatum (L.) Fries ex Nym.]，又名辐状侧蕊，是龙胆科（Gentianaceae）肋柱花属植物[5]。生长于海拔 1400～4200 m 的水沟边、山坡草地，主要分布于我国东北、西南、华北、西北等地区。辐状肋柱花的根呈细圆柱形，断面黄白色，有多数须根，茎具 4 纵棱，有明显的分枝和节，表面是紫褐色或黄绿色，比较质脆，容易折断，叶多破碎，呈条形或条状披针形，面有一突起的脉纹，聚伞花序，花呈长圆状椭圆形，气微香，味苦[6]。目前，主要用于蒙医临床治疗，是“地格达” 2 类蒙药的传统药材之一，常用于蒙医药的多方剂中做主药或辅药，其味苦，性寒，具有平息协日、清热利湿功能，用于发热、头痛、瘟疫、伤寒、黄疸等疾病治疗[7]。 此外，相关药理研究资料显示，辐状肋柱花中主要化学成分的黄酮类、𠮿酮类和三萜类，均具有不同程度的抗肿瘤作用，在一定程度上提示可用于治疗抗肿瘤疾病。
黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，并且结构多样，化学性质稳定，有良好的活性。目前，从辐状肋柱花中共分离鉴定得到 11 个黄酮类化合物，分别为木犀草素[9,11]、木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷[11]、木犀草素-7-O-葡萄糖苷[15]、木犀草素-4'-O-葡萄糖苷[10]、芹菜素[9]、芹菜素-7-O-葡萄糖苷[15]、山萘酚[15]、槲皮素[9]、异荭草苷[13]、异牡荆素[13]、当药黄素[10,14]。
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验药材
实验用辐状肋柱花全草采集于内蒙古地区，鉴定为龙胆科肋柱花属植物辐状肋柱花 [Lomatogonium rotatum (L.) Fries ex Nym.]，凭证标本 （编号：YB-LR20181120）存放于实验室标本库。
2.1.2 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 辐状肋柱花的提取与萃取流程
取干燥的辐状肋柱花全草（9 kg），用 75%乙醇在室温下浸泡提取 3 次，合并 3次的提取液后减压浓缩滤液得到乙醇提取浸膏（2 kg）。将浓缩后的乙醇提取物用适量的水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇三种有机溶剂萃取三次，最终得到石油醚萃取物（209 g），乙酸乙酯萃取物（239 g）和正丁醇萃取物（502 g）。
2.2.2 辐状肋柱花石油醚层的分离
取辐状肋柱花石油醚层萃取物（209 g），用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（12 × 65 cm）干法上样，以 PE : EtOA（c25:1-3:1）溶剂系统进行梯度洗脱之后，再用 CH2Cl2 : MeOH（25:1-3:1）溶剂系统进行梯度洗脱，通过薄层色谱检测，合并相同组分后，共得到 8 个组分（Fr.1~8）。
将 Fr.3（8 g）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（4 × 60 cm）干法上样，以 PE : EtOAc（30:1-3:1）梯度洗脱，通过 TLC 检测，合并相同组分后，共得到 12 个组分（Fr.3-1~3-15），将 Fr.3-5（773.1 mg）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（2 × 40 cm）干法上样，以 PE : CH2Cl2（5:1-1:1）梯度洗脱，得到 5 个组分（Fr.3-5-1~3-5-5）, 接着 Fr.3-5-4（129.1 mg）用 MPLC 进行分离，以 MeOH : H2O（85:15-100: 0）溶剂体系纯化得到化合物 2（7.6 mg）和化合物 3（11.9 mg）。Fr.3-7（126.6 mg）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（1.5 × 35 cm）干法上样，以 PE : CH2Cl2（3:1-1:1）梯度洗脱，纯化得到化合物 1（13.9 mg）。Fr.3-10（1.1 g）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（2.5 × 45 cm）干法上样，以 PE : EtOAc（40:1-10:1）梯度洗脱，共得 8 个组分（Fr.3-10-1~3-10-8），将 Fr.3-10-4（63.9 mg）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（1.5 × 35 cm）干法上样，以 PE : EtOAc（40:1-20:1）梯度洗脱，得到化合物 4（3.8 mg）。Fr.3-10-5（88.2 mg）用 MPLC 进行分离，以 MeOH : H2O（45:55-100: 0）溶剂体系进行洗脱，分离得到化合物 6（15.8 mg），Fr.3-10-7（79.6 mg）同样用 MPLC 进行分离，以 MeOH : H2O（45:55-100: 0）分离得到化合物 10（20.8 mg）和化合物 8（9.1 mg）。Fr.3-12（1.0 g）用正相硅胶（200-300 目）湿法装柱（2.5 × 45 cm）干法上样，以 PE : EtOAc（10:1-3:1）梯度洗脱，共得 4 个组分（Fr.3-10-1~3-10-4），将 Fr.3-12-2（55.9 mg）用 MPLC 进行分离，以 MeOH : H2O（45:55-100: 0）得到化合物 7（8.1 mg）。
第三章 结果与讨论 ..................................... (12)
3.1 化合物的结构鉴定................................ (12)
3.1.1 化合物 1 的结构鉴定........................ (12)
3.1.2 化合物 2 的结构鉴定.................................. (14)
3.1.3 化合物 3 的结构鉴定........................................ (16)
第四章 结论 ................................... (52)
第三章 结果与讨论
3.1 化合物 1-18 的结构鉴定
3.1.1 化合物 1 的结构鉴定
化合物 1：黄色针状晶体，分子式为 C15H12O6，分子量为 288.06。
1H-NMR（300 MHz, chloroform-d）谱显示：2 个羟基氢质子信号 δH (ppm) 11.95 (1H, s, 1-OH)、11.36 (1H, s, 8-OH), 苯环上 4 个氢质子信号 δH (ppm) 7.21 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-6)、6.69 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-7)、6.51 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-4)、6.33 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-2), 2 个甲氧基氢质子信号 δH (ppm) 3.94 (3H, s, 3-OCH3)、3.88 (3H, s, 5-OCH3)。
13C-NMR（75 MHz, chloroform-d）谱共显示 15 个碳信号，包括 1 个羰基碳信号δC (ppm) 184.7 (C-9), 苯环上 12 个碳信号 δC (ppm) 167.6 (C-3)、162.9 (C-1)、157.8 (C-4a)、154.2 (C-8)、145.5 (C-4b)、140.0 (C-5)、120.4 (C-6)、109.4 (C-7)、108.2 (C-8a)、102.9 (C-8b)、98.0 (C-2)、93.2 (C-4), 2 个甲氧基碳信号 δC (ppm) 57.5 (3-OCH3)、56.1 (5-OCH3)。
第四章 结论
本文以辐状肋柱花为药材，首先对辐状肋柱花进行提取与萃取，选取石油醚提取部分进行分离纯化，采用核磁共振波谱法结构鉴定，最后对分离得到的化合物进行抗肿瘤生物活性研究，得出了如下结论：
1. 对辐状肋柱花石油醚提取部分进行分离纯化，共分离得到 18 个化合物。其中，包括 9 个𠮿酮类化合物（1−9），5 个三萜类化合物（10−14），3 个木脂素类化合物（15、16、17）以及 1 个黄酮类化合物（18）。其中，𠮿酮类化合物分离得到较多，说明是辐状肋柱花的主要化学成分。
2. 化合物 2、3 是首次从辐状肋柱花中分离得到，化合物 12、14、17 是首次从龙胆科中分离得到，化合物 5、11、13、15、16 是首次从肋柱花属分离得到。提供了本植物分类标记物的依据。
3. 采用 MTT 法对化合物 1−18 进行宫颈癌细胞（HeL a）、肺癌细胞（A-549）、肝癌细胞（SK-Hep1）的抑制肿瘤细胞活性实验结果表明，化合物 10 和 12 同时对三种肿瘤细胞有明显的效果，其中化合物 10 对三种肿瘤细胞的 IC50值为 14.82 ± 1.53、25.80 ± 3.91 和 8.11 ± 0.78 μM，化合物 11 对三种肿瘤细胞的 IC50值为 21.34 ± 1.62、29.26 ± 2.35 和 16.24 ± 2.09 μM。
4. 本实验对辐状肋柱花进行了化学成分分析及其对肿瘤细胞的抑制活性评价，这一系列实验在一定程度上为今后开发利用蒙药辐状肋柱花奠定了基础数据。本课题只对辐状肋柱花石油醚提取部分进行了研究，对于化学成分的分析还不够全面，因此，对辐状肋柱花的化学成分还需要继续对乙酸乙酯和正丁醇提取部分进行分析工作。
参考文献（略）