传统的结核病诊断方法包括活检组织病理抗酸染色和新鲜组织MTB培养｡结核病是由结核分枝杆菌感染引发的全身多系统疾病,是严重危害人类健康的全球性传染病之一｡我国是全球结核病流行严重的22个国家之一｡因此,早期准确诊断是结核病(TB)患者得以及时治疗的关键,而提高诊断技术对早期发现结核病患者至关重要｡
活检病理抗酸染敏感度不高,容易出现假阴性,且不能区别MTB及非结核分枝杆菌(NTM),另外麻风杆菌抗酸染色显示也为阳性,可干扰结核病的诊断｡新鲜组织MTB培养培性可明确诊断结核及菌型,但培养时间长,且阳性率较低｡因此,要求我们找到快速有效的诊断方法,近年来,结核病分子诊断技术呈迅速发展态势,具有特异度和敏感度高､操作简便､时间短等特点｡本文对分子生物学技术在结核病诊断中的研究进展及应用做简要综述｡
1免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)
IHC是病理学诊断中常用的检测手段,可检测组织标本蛋白表达及分布,广泛的用于肿瘤疾病的诊断及分型｡最近,该方法在结核病病理学诊断中备受关注,为结核病诊断及发病､转归的机制研究提供了方法学支持｡相比其他的免疫学检测方法,IHC对抗体的的要求更高,使用一些非特异的抗体会出现假阳性｡
Che等利用IHC检测MTBAg85B蛋白并与抗酸染色比较,评估其在结核诊断中的价值,检测结果显示,Ag85B表达分布与抗酸杆菌分布一致,但Ag85B免疫组织化学染色信号强度显著优于抗酸染色效果,Ag85B免疫组织化学检测敏感度为53.8%,显著高于抗酸染色敏感度(34.4%)｡同时,他们还报道了在一张切片中同时检测抗酸杆菌和MTB抗原的双重染色方法(ZC染色法),该方法将抗酸染色及免疫组织染色合为一体,将诊断的阳性率进一步提高到65.5%｡IHC较传统的抗酸染色具有敏感度高和快速简便优势,且容易推广实施,在结核病(尤其是肺外结核)病理学诊断中具有良好的应用前景｡
2γ-干扰素释放实验(interferon-gammareleaseassay,IGRA)
结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞,效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子(如γ-干扰素)｡因此,检测特异度的效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断,可以作为机体是否正处于被感染的指标,目前T-SPOT是最常用的检测方法｡
T-SPOT应用酶联免疫斑点技术(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)检测体内经结核特异度的RD1区编码抗原EAST-6和CFP-10刺激后释放γ-干扰素的特异度T细胞数量｡该方法只针对MTB复合群感染,绝大多数环境分枝杆菌(堪萨斯分枝杆菌､苏氏分枝杆菌､海分枝杆菌和戈登分枝杆菌除外)和卡介苗无交叉反应,食品和药物管理局(FDA)统计数据表明其特异度可达到97.1%(297/306),敏感度为96.6%(175/183),在肺结核及肺外结核患者中有很高的检出率｡Yu等比较T-SPOT､痰涂片及结核菌素试验(PPD)3种检测方法,结果显示T-SPOT､痰涂片和PPD敏感度分别为89.41%､63.53%和72.94%;特异度分别为91.43%､100%和62.86%,T-SPOT检测肺结核敏感度和特异度均显著高于PPD试验(P<0.05)｡IGRA作为免疫学诊断方法,在检测潜伏性结核感染及辅助诊断结核病中有很重要的价值,但有其局限性,它并不能区分潜伏性结核感染及活动性结核,也不能预测潜伏性结核感染是否能发展为活动性结核｡
3聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)
PCR技术广泛应用于医学和生物学领域,其具有强大的扩增能力,能把极微量的DNA扩增到琼脂凝胶电泳能检测到的水平;缺点是传统PCR检测总的敏感度尚不理想,同时可能存在污染､操作失当等因素的影响,因此随后产生了多种改进手段,包括PCR体系及操作的改良,如巢式PCR和荧光定量PCR｡
巢式PCR(nestedPCR)是一种变异的聚合酶链反应,使用两对PCR引物扩增完整的片段,第一对引物扩增片段和普通PCR相似,第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部,使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增,增加了检测结果的可靠性｡
荧光定量PCR(real-timefluorescentquantitativePCR,qPCR)技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法｡Park等基于IS6110基因序列,利用巢式PCR法检测肺部组织石蜡包埋样本中的MTB,与培养结果相比,巢式PCR的敏感度和特异度为85%和99%,显著高于抗酸染色及病理组织学检查｡Ye等应用qPCR,以IS6110基因为靶序列对1000例疑似结核组织中MTB进行检测,得出qPCR的阳性检出率要高于齐尼抗酸染色法｡Kim等采用巢式PCR和qPCR对199例石蜡包埋组织标本(包括137例TB标本､17例NTM标本以及45例其他疾病标本)中MTB及NTM特异度基因进行检测,评估其检测组织标本的可行性｡结果显示在TB及NTM标本中,抗酸染色的敏感度为34.3%和17.6%;巢式PCR检测的敏感度为70.1%和52.9%;荧光定量PCR的检测敏感度为70.8%和35.3%｡两种PCR的检测敏感度要显著高于抗酸染色,且均具有很高的特异度,其在FFPE标本中具有良好的TB和NTM检测鉴别能力｡巢式PCR和qPCR与常规PCR相比,特异度更强,自动化程度更高,是临床病原微生物检测鉴定最常用的分子生物学方法｡
4恒温扩增检测技术
MTB恒温扩增检测技术包括RNA恒温扩增实时检测技术(SAT)､环介导等温扩增检测法(LAMP)以及交叉引物扩增技术(CPA)｡SAT技术是国内自主专利技术,是基于RNA恒温扩增的一项核酸扩增技术,其检测结果可作为鉴别菌是否处于活动期的依据,更利于用药之后疗效的监测,以及对是否治愈进行判断｡LAMP技术可直接扩增临床标本中MTBDNA,是一种基于链置换酶扩增的新型的DNA恒温扩增技术,其检测结果肉眼即可观察,整个过程大约1小时｡CPA技术是由恒温扩增技术演变而来的,针对靶序列设计多重交联引物,包括交叉引物,置换引物和延伸引物｡反应由链置换型DNA聚合酶催化,于恒温条件下,在密闭的具有防污染核酸试纸条检测装置中完成｡SAT､LAMP以及CPA3种方法用于检测MTB具有操作简便､快速､敏感､特异等优点,具有很大的市场应用前景｡
5结核易感基因检测
结核病发生与发展过程中,宿主易感基因的作用日益受到重视,越来越多的结核病候选易感基因被确认,其与结核病的相关性可以作为结核病诊断的依据｡Zheng等比较了MTB北京株与非北京株感染的巨噬细胞,结果表明有北京株感染的巨噬细胞有13种microRNA表达下调,此外hsa-miR-101和hsa-miR-150在活动性结核患者和潜伏性结核感染人群中表达水平差异有统计学意义｡Chai等研究结核性脑膜炎患者脑脊液及血浆中hsa-miR-125b､hsa-miR-29a和hsa-miR-155-5p的表达水平时发现:结核性脑膜炎组hsa-miR-125b和hsa-miR-29a的表达水平与对照组相比显著上调,其可以做为诊断结核性脑膜炎潜在的生物学标志｡人类白细胞抗原(HLA)基因是人体免疫调控基因之一,是具有多态性的基因,在抗原递呈和免疫应答中起着重要作用,在控制人体对疾病的易感性方面发挥着重要功能｡研究表明HLAI类基因中HLA-B可能是易感基因,HLA-II类基因中HLA-DR和DQ0基因与结核发病相关｡
近年来,研究发现自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1(NRAMP1)基因与结核病的易感性有关,其主要功能是通过改变含有微生物的吞噬体液泡内环境来控制微生物复制,从而消灭胞内菌｡通过对易感基因多态性与结核病的关联分析,进一步了解MTB的感染机制以及对结核病发生的危险因素有了更深的认识｡
6反向斑点杂交技术(reversedotblot,RDB)
RDB是一种结合基因扩增和分子杂交的基因诊断技术,由Saiki等提出,其原理先将特异度探针固定于膜上,再将待测的DNA样本(一般为特异度的PCR产物,并预先对PCR引物5’端进行生物素标记,使扩增产物相应的带有生物素标记)与之杂交,探针与待测样本DNA单链通过碱基互补配对的原则相结合,凡是与待测DNA样本结合的探针均带有生物素标记,加入亲和素偶联的酶后,通过酶底物结合进行显色,进而判断杂交结果｡Jiang等利用RDB检测97例病理石蜡组织中MTB,与荧光定量PCR及抗酸染色相比,RDB具有较高的敏感度和阳性检测率｡Munkhdelger等利用膜RDB在石蜡包埋组织中成功鉴定多种NTM,其阳性检出率可达到95%｡
RDB操作简单､敏感度高､特异度强,在MTB基因诊断领域中(尤其在基因分型方面)具有重要的地位,RDB可平行检测对多个靶基因,实现高通量的MTB分型检测,具有很高的临床应用价值｡
7变性高效液相色谱法(DHPLC)
DHPLC由Oefner等在1995年提出,即把接近DNA解链温度条件下进行的离子对反向色谱分析,是一种新型核酸检测分析技术,具有分辨率高､自动化､高通量和成本低等优势｡Chen等建立多重PCR-DHPLC快速检测MTB复合群特异度IS6110和IS1081插入序列,其具有很高的特异度,检测敏感度达到每个反应102基因拷贝,该法临床检测可缩短至24小时之内｡结核病的正确诊断是患者获得及时治疗的关键,长期以来,结核病的诊断主要依赖细菌学涂片和培养｡近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,为结核病的诊治提供了新方法｡文章着重介绍结核分子病理学诊断技术的新进展,并对其应用的可行性予以客观分析｡
8结核耐药相关基因检测
目前,结核的早期诊断是临床治疗的关键,常规的细菌学检测直观､简便仍是重要的实验室及诊断方法,但检测的敏感度有很大的缺陷,容易出现假阴性｡全球大约有1/3的人感染MTB,其中5%~10%的感染者最终发展成为结核病患者｡目前药敏试验是诊断耐药结核病的金标准,由于治疗方案的不合理及检测手段的局限性,导致结核病患者对一种或几种抗结核药物产生耐受性｡随着分子生物学的发展各种新的技术也越来越多的用于辅助耐药结核的诊断,如线性探针技术(LPA)､多色PCR荧光熔解曲线技术(MMCA)及X-pertMTB/RIF等｡
Nathavitharana等采用德国Hain公司二代GenoTypeMTBDRplus系统检测利福平和异烟肼耐药,与药敏检测比较其检测利福平耐药的敏感度和特异度为97.1%和96.5%,检测异烟肼耐药的敏感度和特异度为94.4%和94.9%｡该方法可用于临床标本耐药性快速检测｡MMCA技术由厦门致善生物公司研发,其原理是基于双标记自淬灭的探针溶解曲线技术检测基因突变｡
Li等评估PCR-探针溶解曲线法在临床诊断耐药结核中的价值,以常规的比例药敏法为标准,PCR-探针溶解曲线法检测利福平耐药的敏感度和特异度分别为97.5%和96.2%,并与DNA测序结果完全一致,表明该方法在快速检测结核耐药方面有很好的应用前景｡X-pertMTB/RIF技术不但可以用于MTBDNA检测,并且可以用于检测MTB对RIF的耐药性｡Boehme等通过对6个结核高负担国家6648个疑似携带结核杆菌及耐药结核杆菌的患者进行检测,评价X-pertMTB/RIF技术在基层医疗机构使用的可行性,对于培养验证的样本,X-pertMTB/RIF检出率为90.3%(933/1033),涂片检测率为67.1%(699/1041);利福平耐药患者检出率为94.4%(236/250),特异度为98.3%(796/810),该系统可以用于肺结核的快速诊断,有较高的特异度和敏感度｡
分子生物学技术是快速有效的检测方法,具有很高的敏感度和特异度,对结核病的临床诊断上具有良好的应用前景｡总之,随着结核病诊断技术研究的不断深入,对于指导临床规范用药以及减少结核病的传播有着深远意义｡
参考文献:(略)