第一部分 逆转录病毒介导建立人诱导多能干细胞系相关技术研究
如前所述，目前国际上已报道了逆转录病毒法、慢病毒法等多种方法诱导包括成纤维细胞等多种成体细胞重编程获得iPS细胞系，然而由于逆转录病毒诱导方法重复性好，皮肤成纤维细胞易于获得等特点，目前世界上大部分实验室采用逆转录病毒诱导成纤维细胞建立iPS细胞系。本实验室前期工作中已成功从外科手术中皮肤中建立人成纤维细胞系的方法，并从废弃胚胎中得到27株人ES细胞系，具有成纤维细胞及ES细胞的培养经验，但是尚未成功建立人iPS细胞系，另外由于皮肤只能通过手术或皮肤活检取得，具有一定的创伤性而不能完全被病人接受，且不适用于凝血障碍性疾病。已有文献报道，可以从直接拔取的毛发细胞中获得角质形成细胞并能诱导成iPS细胞，因此毛发来源细胞可越过这些缺点而易于被人接受，然而本实验室尚未能建立从毛发中获取角质形成细胞的方法；目前普遍认为毛囊干细胞定位于毛囊的隆突区，隆突激活假说提出干细胞集中于毛囊隆突部，且是毛囊更新的细胞来源。有文献报道利用干细胞慢周期特性和毛囊生长周期特点对人毛囊进行体外分析发现，毛囊干细胞在胚胎期定位于隆突区，而在成人中，有部分毛囊干细胞还存在于毛囊下段隆突区以下的外根鞘中，毛囊干细胞与表皮干细胞类似，和神经干细胞一样同属外胚层分化而来。
因此本部分实验的研究目的在于（1）研究从直接拔取的毛发细胞中培养细胞，建立无创性获得并建立成体细胞系的方法，为进一步建立iPS细胞提供细胞来源；（2）采用基于逆转录病毒介导的基因导入方式重编程人成纤维细胞为iPS细胞，建立新的iPS细胞系，从而掌握逆转录病毒载体法重编程成体细胞为iPS细胞的技术，同时为进一步获得疾病相关的多能细胞提供新模型。
1.1 材料与方法
1.1.1细胞培养用试剂及耗材
DMEM培养基（DuIbecco’s modified eagIe’s medium，DMEM）、OPTI-MEM、Knockout血清替代物（Knockout Serum Replacement，KSR）、胎牛血清（fetal bovineserum，FBS）、DMEM/F12、B27、非必需氨基酸(MEM Non-Essential Amino Acids，NEAA)、L-谷氨酰胺(L-glutamine)、青霉素—链霉素溶液(Pen—Strep solution)、Gelatin、2-巯基乙醇、胰蛋白酶、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、血清替代物Knockout Serum Replacement（Knockout SR），Collage Ⅳ和 Dispase等购自Invitrogen公司，Mitomycin C购自Roche公司，胎牛血清购自四季青公司及GIBCO公司，基质胶、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）购自美国Peprotech公司。实验中细胞培养相关耗材全部购自corning公司。..................
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第二部分 麦管法玻璃化冷冻保存人诱导多能干细胞
目前iPS冷冻保存与ES细胞一样，主要采用常规的慢冻快融方法，具有复苏率低，复苏后分化倾向严重等问题，因此需要寻找一种合适的方法冷冻保存iPS细胞。传统的玻璃化冷冻是继常规慢速冷冻方法之后发展起来的一种超速冷冻方法，应用高浓度的冷冻保护剂溶液在超速冷冻过程中，形成一种极其粘稠的固化状态，避免了细胞在冷冻及解冻直至恢复细胞生物活性中冰晶的形成。1971年，Whittingham报道了将小鼠胚胎在-196℃冷冻保存获得成功后，目前玻璃化冷冻法广泛应用在保存人和其他多种哺乳动物的胚胎、卵母细胞、卵巢组织等方面。2002年澳大利亚的Reubinoff 等、2004年Zhou等分别报道了应用玻璃化冷冻法保存hESCs取得成功。iPS细胞与ES细胞十分类似，玻璃化冷冻方法是否适用于iPS的冷冻保存尚未有报道。本部分实验研究目的在于探索麦管化玻璃化冷冻方法是否适用于人iPS细胞，对其多能性有无影响。
2.1 材料与方法
2.1.1 玻璃化冷冻所需细胞试剂及耗材
细胞及耗材：人 iPS 细胞系是来由加州大学洛杉矶分校人类遗传实验室提供；CF1 孕鼠和严重联合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodeficiency, SCID)由 UCLA 动物中心提供。冷冻麦管购自德国 Minitube 公司(19040-0016)。
细胞培养试剂：iPS 细胞培养方法及所需试剂同第一部分；B27、层粘连蛋白（fibronectin，FN）、Hank’s 平衡盐溶液（Hanks’balanced salt solution，HBSS）、4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid,HEPES) 、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和 TRIZOL 为 Inventrogen 公司产品；蔗糖、乙二醇（Ethylene Glycol，EG）,多聚鸟氨酸（polyornithine，PO）、鼠抗人 β-微管蛋白Ⅲ（Neuronal Class III β-Tubulin, TuJ1）和胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein, GFAP）单克隆抗体为 Sigma 公司产品；鼠抗人SSEA-4，鼠抗人 TRA-1-60, CY2 藕联抗兔 IgG/IgM、CY3 藕联抗兔 IgG/IgM 及CY3 藕联抗鼠 IgG/IgM 抗体为 Chemicon 公司产品，鼠抗人 SOX2 蛋白、兔抗人OCT4 蛋白为 Santa Cruz 公司产品；兔抗人 NANOG 蛋白，鼠抗人巢蛋白（nestin）单克隆抗体为 ABcam 公司产品。......................
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目 录
中文摘要.............................................1
Abstract....................................................6
前 言......................................................9
第一部分 逆转录病毒介导
建立人诱导多能干细胞系相关技术研究..........14
1.1 材料与方法.....................................................14
1.2 结 果 ...........................................................28
1.3 小 结..........................................................32
第二部分 麦管法玻璃化冷冻
保存人诱导多能干细胞..................................33
2.1 材料与方法...............................................33
2.2 结 果........................................................36
2.3 小 结.................................................39
讨 论....................................................40
结 论...................................................48
参 考 文 献.........................................49
结 论
本研究中玻璃化冷冻和解冻是在室温条件下操作的，且效果较理想，但Van等认为室温条件下高浓度的玻璃化冷冻液对细胞毒性作用较大，效果差于较低温度如4℃环境，因此iPS细胞玻璃化冷冻和复苏的温度条件是否需要进一步优化以尽可能减少冷冻保护剂的细胞毒性等可待进一步研究。
（1） 在本学科干细胞中心成功从人皮肤中建立稳定的成纤维细胞系，并初步从直接拔取的毛囊中得到贴壁生长的细胞，有望为建立iPS细胞提供无创性的细胞来源；
（2） 采用携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种基因的逆病毒载体进行病毒生产，将病毒以一定的比例混合感染成纤维细胞诱导重编程，在本学科干细胞中心成功建立了iPS细胞系；
（3） 由于体细胞启动重编程需要这四种基因的协同作用，且需维持一定的表达水平才能实现，该方法则不能保证被感染的细胞内同时含有上述四种基因，且四种基因很难同时维持适中的表达水平，故采用此方法将外源基因导入体细胞重编程的效率并不高；有待于进一步的技术研究。
（4） 首次将普通麦管玻璃化冷冻方法应用于保存人iPS细胞，玻璃化解冻后iPS细胞仍然具有ES样多能性特征。
（5） 本课题引进和优化了人iPS细胞的相关技术，为本学科开展iPS细胞研究及潜在的临床应用奠定了基础。
基因组研究发现慢冻快融法冻融ES细胞晚期观察点发生冷冻ES细胞凋亡、胚胎形态发生、成骨分化、器官发生、重编程、血管发生和细胞死亡等相关表达上调。本研究初步发现玻璃化冷冻后iPS复苏率明显升高，不影响其多潜能及定向分化能力；然而对于玻璃化冷冻后iPS细胞基因组遗传及表观遗传学的改变仍不可知，需要进一步研究。
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