本文是一篇医学论文，笔者经过研究，得出以下结论：1.IAV 感染巨噬细胞抑制 Nr4a1 的基因表达，其中 PA 和 PB2 蛋白是抑制 Nr4a1 的基因表达的关键蛋白分子。 2.Nr4a1 表达促进 I 型 IFN 产生和抑制病毒复制，而缺失或敲低 Nr4a1 则抑制 I 型IFN 产生和促进病毒复制。
1 前言
1.1 流感病毒与天然免疫反应
1.1.1 流感病毒概述
流感病毒属于正黏病毒科，分为四个型 (A 型、B 型、C 型和 D 型)，其中 A 型流感病毒 (IAV) 可以感染多种动物(Cox et al., 2004)。IAV 基因组长约 13,500 个碱基，由八条单股负链 RNA 组成，编码不同的蛋白质，包括 HA、NA、M1、M2、NP、NS1、NS2、PA、PB1、PB2 (Ghedin et al., 2005)。其中有两个 mRNA 片段可以使用不同的起始/终止密码子进行翻译，以产生 PA-X、N40 和 PB1-F2。在病毒粒子中，NP 和 3 个病毒聚合酶亚基与 vRNA 结合，形成 8 个病毒核糖核蛋白(vRNPs)。八个 vRNPs 被 M1 和一层来自宿主细胞的脂膜所包围，膜内嵌有 HA、NA 和 M2。NS1、NEP、PB1-F2、PA-X和 N40 只在感染细胞中表达，在病毒粒子中不表达。IAV 的复制周期始于 HA 蛋白与呼吸道上皮细胞、树突状细胞、肺泡巨噬细胞表面的唾液酸结合(Mansour et al., 2012; Werner et al., 2014)，病毒通过内吞作用，然后运输到次级内体(Edinger et al., 2014)。次级内体内的酸性环境促进了 HA 介导的病毒和内体膜的融合，随后 M1 降解并且 vRNPs在细胞质中释放(Banerjee et al., 2014; White et al., 2016)。vRNPs 进入细胞核(Pumroy et al., 2015)，在细胞核中，负义 vRNA 通过病毒聚合酶转录成正义 mRNA(Reguera et al., 2016; Te Velthuis et al., 2016)。病毒蛋白在细胞质通过核糖体以帽依赖的方式中由 mRNA翻译而来。合成的病毒蛋白有部分被输入细胞核以复制 vRNA。新组装的 vRNPs 和病毒蛋白被运输到细胞膜的顶端，在那里病毒粒子由 NA 组装和释放(Lakdawala et al., 2016)。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的结构和特征，IAV 可以继续分类。IAV 存在 18种的 HAs 和 11 种的 NAs，到目前为止，已确定有 16 种 HA 亚型和 9 种 NA 亚型在动物和人类中流通(Medina et al., 2011)。在个体中多种病毒株混合感染可能会导致基因的重新分类（抗原性转变），从而产生新的亚型，从而可能导致全球流感爆发(Zeng et al., 2017)。
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1.2 孤儿核受体 Nr4a1 研究进展
1.2.1 核受体简介
核受体是细胞内一类转录因子的统称，核受体家族的成员在细胞生长发育、分化与代谢均起到了重要的作用，并且与多种病症有关，如癌症、心血管疾病、炎症及生殖异常(Giguère, 1990; Mangelsdorf et al., 1995; Margolis et al., 2010)。根据与它们结合的配体的不同类型，核受体可分为三类：I 类包括类固醇激素受体，包括雄激素受体，雌激素受体和糖皮质激素受体；II 类包括非类固醇激素受体，包括甲状腺激素受体，视黄酸受体和维生素 D 受体；III 类包括孤儿核激素受体，包括 Nr4a1，NoR-1，TR2(Olefsky, 2001)。研究发现核受体能够通过与特异性的配体结合然后被调控，因而可以作为良好的药物靶点(Chen, 2008; Chen, 2010)。在早期阶段对核受体的研究主要集中在核受体的基因型功能，即结合到 DNA 相应反应元件上的来调控靶基因的表达，或者是通过与其他转录因子相互作用，共同与 DNA 结合来调节基因的表达。然而近期的一些研究，人们发现部分核受体还具有非基因型功能，能够移位到不同的亚细胞结构上，通过与不同蛋白之间的相互作用，快速调控细胞内信号转导通路，发挥广泛的生物学功能。从结构上讲，核受体通常分为五个区：A / B 区，C 区，D 区，E 区和 F 区。A/B 区处于核受体的 N 端，保守性最低，它包含转录激活域 AF-1（Activation Function-1），AF-1 能够被共激活因子或其它转录因子识别，介导配体非依赖性的转录激活(McEwan, 2016)。C 区处于核受体的中央，为高度保守的 DNA 结合结构域(DNA-binding domain, DBD），包含两个高度保守的锌指结构(Germain et al., 2006; Rastinejad et al., 2013)。D 区称为绞链区，位于 DNA 结合区（C 区）和配体结合区（E 区）之间，较短并且不保守，还包括部分核定位信号肽 NLS（Nuclear Localization Signal），可以改变蛋白质的结构，以及增加蛋白质的柔韧性(Chandra et al., 2008)。E 区，即配体结合区（Ligand-binding domain，LBD），是最大的结构域，整体的构架很保守，部分的序列变化保证了其对选择型配体的识别，E 区通过螺旋结构形成了配体结合口袋。此外 E 区还参与介导核受体二聚化以及与其它转录相关蛋白相互作用的重要功能，并包含配体依赖性激活功能 2（AF-2）域(Chandra et al., 2008)。F 区仅存在于某些核受体中，并且序列高度可变，位于 C 端。
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2 材料与方法
2.1 仪器设备
表 1 主要仪器清单
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2.2 实验动物
C57BL/6 背景的 Nr4a1 基因敲除小鼠由陆军军医大学刘新东教授惠赠。6-8 周龄性别一致的野生型和 Nr4a1 基因敲除小鼠用作后续试验。所有小鼠饲养于清洁级实验动物房，温度控制在 22-28℃、相对湿度 40%-60%，昼夜交替时间为 12 h，所有实验操作均严格遵守山东农业大学实验动物管理委员会对实验动物福利与伦理的要求。
鼠源单核巨噬细胞（RAW264.7）、人胚肾细胞（HEK293T）、小鼠永生化骨髓巨噬细胞（iBMDMs）、小鼠成纤维细胞（L929）由本实验室保存。pEGFP-C1-Nr4a1、pcDNA3.0-Flag-Nr4a1、pLKO.1-Nr4a1、pCDH-Nr4a1 由实验室构建保存，带 Flag 标签的 IAV M1、NP、NEP、PA、PB1、PB2 和带 Myc 标签的 IAV NS1 质粒均由中科院微生物所提供，带 Flag 标签的 RIG1-N、MAVS、TBK1、IRF3-5D 表达质粒，荧光素报告基因质粒 pGL3.0-IFNβ-Luc，pGL3.0-Nr4a1-Luc 为实验室保存。流感病毒（WSN 毒株）、仙台病毒（SeV）和水疱性口炎病毒（VSV）均由本实验室保存。
表 2 SDS-PAGE 分离胶配方（5 mL）
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3 结果与分析 ..................................... 25
3.1 流感病毒感染抑制 Nr4a1 的表达 ................................... 25
3.2 流感病毒 PA 和 PB2 蛋白抑制 Nr4a1 的基因转录 ........................................ 26
3.3 敲低 Nr4a1 巨噬细胞系的构建 ............................... 27
4 讨论 ................................ 35
5 结论 ............................................... 37
4 讨论
流感病毒的感染对动物和人类健康存在很大的威胁，病毒已经进化出多种策略，通过阻断 IFN 生成和 ISG 表达来规避宿主的天然免疫。孤儿核受体 Nr4a1 作为一个多功能蛋白，参与到细胞分化增殖、凋亡调控、代谢控制与炎症反应等过程。在病毒与宿主的战斗中，入侵的病原体进化出多种策略来对抗宿主抗病毒免疫信号，如抑制对病毒RNA 的识别(Manokaran et al., 2015; Chan et al., 2016)，阻止 RIG-I 和 MAVS 之间的结合(He et al., 2016)，或阻止 TBK1、IRF3 的激活(Dalrymple et al., 2015; Zhu et al., 2019)，导致病毒逃避宿主免疫监控。虽然核受体 Nr4a1 现在被认为参与了炎症过程和免疫反应的调节，但它在宿主防御病原体方面的作用在很大程度上是未知的，其控制宿主抗流感病毒免疫信号激活的分子机制仍然不清楚。
在本研究中，我们首先发现 IAV 感染巨噬细胞后能够显著抑制 Nr4a1 的表达。以往的研究表明，在细胞中过表达乙型肝炎病毒(HBV)的 X 蛋白后可以上调 Nr4a1 的基因表达，而 Nr4a1 参与了 FasL 的上调，所以 Nr4a1 可能参与引导 HBV 诱导的 Fas/FasL 信号通路，从而清除入侵的 Fas 表达的淋巴细胞，有利于病毒的生存与扩散(Lee et al., 2001)。在肝细胞中，丙型肝炎病毒 HCV 核心蛋白通过抑制 Nr4a1 和 RUNX3 的表达增加耐药性，抑制细胞凋亡，也利于病毒的生存(Tan et al., 2015)。此外，细胞因子、炎症刺激是促进 Nr4a1 的表达上调(Watanabe et al., 2001; Martínez-González et al., 2003; Pei et al., 2005)。本研究中我们发现 Nr4a1 是先天免疫信号的正调节因子，所以流感病毒感染细胞后显著抑制 Nr4a1 表达的意义也是逃避宿主的天然免疫，抑制干扰素的产生，从而促进自我复制。
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5 结论
IAV 感染巨噬细胞抑制 Nr4a1 的基因表达，其中 PA 和 PB2 蛋白是抑制 Nr4a1 的基因表达的关键蛋白分子。
2.Nr4a1 表达促进 I 型 IFN 产生和抑制病毒复制，而缺失或敲低 Nr4a1 则抑制 I 型IFN 产生和促进病毒复制
3.Nr4a1 通过调节 IRF3 磷酸化影响 I 型 IFN 产生和下游 ISG 的表达。
参考文献（略）