第 1 章 文献综述
1.1 引言
支链氨基酸（Branched chain amino acids，BCAA）属于动物机体的三种必需氨基酸，是在氨基酸碳架上具有侧链的氨基酸的统称，在机体物质代谢过程中三种氨基酸存在着相互拮抗相互抑制的作用[1]，其中以亮氨酸为主要的作用团体，与其他类型的氨基酸不同的是，支链氨基酸是唯一可在肝脏外代谢的氨基酸，其主要的氧化代谢部位在肌肉组织中。BCAA 主要是通过参与机体内的三羧酸循环过程中的生糖与生酮作用，从而以此来实现机体中的三大营养物质的相互代谢和转化过程[2]。研究表明[3]支链氨基酸在肌肉中参与生酮生糖等代谢过程，从而使机体骨骼肌中不同类型的肌纤维得到更加充分的能量。由于支链氨基酸具有高于其他类型氨基酸的氧化功能效果，以及在肌肉中代谢的特点，使得支链氨基酸在骨骼肌生长修复，健身等领域的研究日益增多。
研究表明[4]，支链氨基酸对骨骼肌的增长修复有着直接的作用，但其基本机理的阐述仍存在较多的争议。一部分学者认为支链氨基酸是由于直接参与了肌肉中蛋白的合成，从而使肌肉组织中的蛋白合成效率大于分解效率，从而使得肌肉增长[5]，该理论是基于成年动物在正常情况下，骨骼肌不发生增长与萎缩，是因为其中蛋白的合成与分解达到动态平衡的结果而成立，因此该理论目前支持的人数较多，另有部分学者认为[6]支链氨基酸，不仅是在动物骨骼肌相关蛋白产生中发挥直接作用，更有可能是由于支链氨基酸参与调控了促进肌纤维组织生长修复相关因子的合成与释放的过程，魏源等[7]研究发现，机体在运动中总是会不可避免地发生肌纤维损伤，尤其以Ⅰ型肌纤维最为常见，在此条件下机体可引发卫星细胞增殖过程，从而使其发挥干细胞修复作用，而支链氨基酸是否对骨骼肌卫星细胞的增殖具有积极的诱导作用，目前仍缺乏相应研究。
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1.2 支链氨基酸代谢特点
氨基酸是蛋白质合成的基础原料。动物机体内大概有 20 种氨基酸参与了蛋白质的合成。BCAA 的合成途径仅仅局限于植物体或是一些细菌体内，是人体的一种必需氨基酸，必须通过外界食物摄取获得，从营养代谢角度来说又是生命活动所必不可少的物质，所以也称为必需氨基酸。从外界获取适量的 BCAA 能够满足机体内的生长以及代谢需求，而摄入量过低则会造成机体生长代谢出现异常等现象[13]。除此之外 BCAA 的先天性代谢失常或从外界摄入的含量过多都将会对机体的中枢神经系统造成一定的毒副作用[14]。因此，维持机体内 BCAA 的动态平衡就显得尤为重要，其过程需要 BCAA 降解酶来发挥其重要作用。
BCAA 的分解代谢途径主要包括 2 个阶段：一个是转氨基过程，另一个是生成支链α-酮酸氧化脱酸反应过程[15]。BCAA 降解酶分布较为广泛，通常情况下，支链氨基酸的降解在细胞质中进行，但是在中枢神经系统内，BCAA 的降解过程在线粒体中完成。BCAA 与其他氨基酸的不同之处在于，它的分解代谢过程不仅是在肝脏中，肝脏只是其代谢初级产物 BCKA 的重要代谢场所。摄取的食物经过胃肠道的吸收后，其中的支链氨基酸被吸收进入肌肉，在肌肉中通过转氨酶作用生成支链 α-酮酸（Branched chain ketones acid BCKA）。BCKA 再随血液流动进入肝脏，在 BCKA 脱氢酶催化作用下，进行氧化脱羧反应。BCAA 在人体内的分解部位见图 1-1。
图 1-1 引自 Susan M 等 Branched-Chain Amino Acid Metabolism
第 2 章 饲喂 BCAA 小鼠骨骼肌形态学特征
2.1 材料与方法
2.1.1 实验材料
（1）实验试剂
生理盐水、支链氨基酸纯粉（Leu:Ile:Val=4:1:1）（浙江一诺生物科技有限公司）、HE 染色液（索莱宝）、Masson 染色液（索莱宝）、Gomori 染色液（索莱宝）、4 %多聚甲醛（国药集团）、2.5 %戊二醛（阿拉丁）、无水乙醇（国药集团）、二甲苯（国药集团）、固体石蜡（国药集团，52-54 ℃、54-56 ℃、56-58 ℃、58-60 ℃）。
（2）实验器材
小鼠灌胃针（8 号）、1 mL 注射器、5 mL 离心管、磨砂边载玻片、盖玻片、小动物台秤（HC311）、组织包埋框、全自动组织脱水机（YD-12P）、自动包埋机（YD-6D）、石蜡切片机（Leica）、组织烤片机与摊片机（YD-AB）、烘箱（DHG-101）、小动物解剖器械包、小鼠恒温游泳池（DB080）、显微摄像系统（Olympus-CX31）。
2.1.2 实验方法
（1）小鼠饲养实验
小鼠选用 KM 小鼠，8 周龄雄性小鼠 70 只，体重为 20~25 g，试验随机共分为 7 组，每组 10 只，其中补充饲喂 BCAA 实验组为 5 个剂量组，分别是 1g/kg·d(1)、2 g/kg·d(2)、3 g/kg·d(3)、4 g/kg·d(4)、5 g/kg·d(5)，各组按小鼠体重给药，且给药后 30 min 进行游泳训练。另外两组分别为不灌胃不运动（背景组，Background group，BG）以及灌胃生理盐水后运动（对照组，Control group，CG），所有运动小鼠运动强度为持续游泳 45 min，饲养期间每周称重，实验共进行 50 d。
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2.2 实验结果
2.2.1 小鼠生长性能相关特征
图 2-1 小鼠体重周增长（左）；小鼠腓肠肌湿重/体重比（右）
上图可见，在相同饲喂量的条件下，每日运动的小鼠体重增长速度显著快于背景组小鼠，在使用 BCAA 的各组小鼠中体重的增长高于对照组，且小鼠体重的增加速度与其使用支链氨基酸的浓度呈正比。腓肠肌湿重体重比数据可见，运动后小鼠腓肠肌增重明显，且 BG 与 CG 间具有显著差异，而在使用支链氨基酸饲喂小鼠并运动后小鼠腓肠肌重量进一步显著增加，且同体重增加趋势一样，小鼠腓肠肌增重与其 BCAA 浓度呈正比。
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第 3 章 饲喂 BCAA 小鼠运动相关生化分析.........................30
3.1 材料与方法.........................30
3.1.1 实验材料.........................30
3.2 实验结果.........................30
第 4 章 饲喂 BCAA 小鼠骨骼肌中 IGF-1、SIRT1 及 COXⅣ的研究.................35
4.1 材料与方法...............35
4.1.1 实验材料......................35
4.1.2 实验方法...................35
全文结论.......................44
第 4 章 饲喂 BCAA 小鼠骨骼肌中 IGF-1、SIRT1 及 COXⅣ的研究
4.1 材料与方法
4.1.1 实验材料
（1）实验试剂
鼠抗兔 IGF-1、SIRT1 及 COXⅣ一抗（1：500）（上海优宁威生物）、兔抗鼠 HRP二抗（1：500）、DAB 显色试剂盒（索莱宝生物），PBS 缓冲液、柠檬酸抗原修复液、5%牛血清蛋白、3%双氧水、苏木精复染液、氨水反蓝液、素木精分化液体（武汉塞维尔生物有限公司），RNA 提取试剂盒、cD AN 反转录试剂盒、SYBRGreen 试剂盒（宝生生物有限责任公司），琼脂糖、ddH2O、酒精、二甲苯、固体石蜡（泰盛蜡有限公司）。
（2）实验器材
实时荧光定量 PCR 仪（Stepone plus）、微波炉、组化笔、组化湿盒、4℃冰箱、离心机（D3024R）、加样枪、TIP 枪头、磨砂边载玻片、盖玻片、组织包埋框、全自动组织脱水机（KH-TS）、自动包埋机（YD-0254）、石蜡切片机（Leica RM2235）、组织烤片机与摊片机（BIOBASE BK-PIII）、烘箱、显微摄像系统（Olympus BX53）。
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全文结论
（1）运动训练同时补充 BCAA 的小鼠腓肠肌增重明显，肌纤维密度与直径增高，运动耐力更强，不容易疲劳。Ⅰ型与Ⅱ型肌纤维的比例发生较大变化，小鼠腓肠肌弹性纤维明显增多，运动耐力更好。超微结构显示，长期运动训练后的小鼠骨骼肌组织中线粒体大小显著增大，而在使用 BCAA 后则迅速下降，且逐渐恢复至正常水平；但与之相反的是线粒体数量在运动后及使用 BCAA 后呈现迅速上升趋势，另外 BCAA 组的小鼠还出现线粒体膜与内嵴厚度显著增大的现象，骨骼肌运动能力以及抗疲劳能力增强，但过高剂量的 BCAA 并不能更高层次的提升骨骼肌的各项功能。
（2） 运动训练使小鼠血液中红细胞数量显著升高，补充 BCAA 对其并无显著影响。运动同时补充 BCAA 可以使小鼠平均红细胞体积增大，平均红细胞血红蛋白含量增高，血液携氧能力提高，肌肉组织有氧代谢增强。运动训练后小鼠血乳酸、肌乳酸含量显著高于不运动组；运动同时补饲 BCAA 组血乳酸、肌乳酸含量均有显著下降，但肌乳酸仍高于背景组。其次补饲 BCAA 浓度在 3 g/kg•d 以下时无毒性反应，当浓度继续升高时，谷丙转氨酶含量显著上升，镜下可见肝细胞损伤，且伴有局灶性坏死。另外尿素氮含量显著上升，可见肾小球肿大，球囊间隙消失，近曲小管管腔狭窄。
（3）饲喂 BCAA 的运动小鼠腓肠肌中 IGF-1 蛋白表达量显著上升，且蛋白及其基因的表达量与BCAA 浓度呈正比，IGF-1蛋白表达于肌纤维胞浆，细胞核中不可见。SIRT1蛋白则在细胞核中强表达，细胞浆中有表达但强度较低，SIRT1 蛋白与基因表达趋势一致，两者与 BCAA 浓度呈反比关系，但在最高剂量组中结果相反。COXⅣ蛋白在腓肠肌中大量分布在肌浆中，且蛋白分布呈点状线性排列，表达量方面 COXⅣ与其基因相一致且与 BCAA 浓度呈正比。
（4）综合各因素考虑，饲喂 BCAA 浓度在 3g/kg·d 时，对小鼠肌肉增长及运动后疲劳恢复能达到较好的效果。
参考文献（略）