第一章 文献综述
1 牛细小病毒概述
牛细小病毒（Bovine parvovirus, BPV）是一种无包膜的单股线性 DNA 病毒，属于细小病毒科细小病毒亚科牛犬细小病毒属成员，犬极小病毒(Minute virus ofcanines, MVC)、人博卡病毒（Hunman bocavirus, HBoV）[1-3]也是该属成员，BPV 流行可引起犊牛腹泻疾病，且与牛繁殖障碍相关[4]。BPV 可通过胎盘由妊娠母牛传播给胎牛引起流产和死胎，犊牛感染 BPV 可呈消化机能障碍。宿主消化道粘膜细胞是BPV 易感部位，易感细胞感染后出现皱缩、扁圆、溶解等病变现象[5-7]。
1961 年 Abinanti 和 Warfiled 初次从健康犊牛胃肠道分离鉴定出 BPV，因其具有血细胞吸附性，命名为红细胞吸附肠炎病毒（Hemadsorping enteria, HADEN）病毒，1966 年日本科研人员从腹泻犊牛粪便和流产胎牛中分离出 BPV，其中 C134 株与 HADEN 病毒株特性不同，HADEN 株和 C134 株分别被定义为 1 型和 2 型 BPV，随后，我国学者从犊牛鼻液中分离出 BPV（B-2 株），美国学者从犊牛腹泻粪便中分离出 BPV，目前该病在全球范围内流行[8-10]。
BPV 呈球形或六角形，以完整病毒粒子或空衣壳病毒粒子形式存在，基因组长度为 5.5kb[11-13]。基因组两端存在回文发夹结构，基因组包括三个开放阅读框（Openreading frame, ORF）,从 5′端到 3′端依次为 ORF1 编码非结构蛋白 1（Nonstructuralprotein 1, NS1）、非结构蛋 2（Nonstructural protein 2, NS2），ORF2 编码核磷蛋白（Nuclear phosphoprotein, NP）和 ORF3 编码病毒衣壳蛋白 1（Capsid viral protein 1,VP1）和核衣壳蛋白 2（Capsid viral protein 2, VP2）。细小病毒属 5′端 ORF 序列保守，同源性较高,3′ 端 ORF 序列较 5′端为可变序列[11-13]。
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2 牛冠状病毒概述
牛冠状病毒（Bovine coronavirus, BCoV）属于套式病毒目，冠状病毒科，β冠状病毒属 2a 亚群成员[23]，是导致牛腹泻的主要病原之一，牛群感染 BCoV 后，犊牛出现水样腹泻，成年牛冬痢，肠出血、脱水、消瘦等症状[24-26]。该病无季节性，在世界范围广泛分布，给牛场带来了严重的经济损失[27-28]。
BCoV 是单股正链 RNA 病毒，基因组长度为 27～32kb，包括 13 个 ORFs，两侧有 5′和 3′非编码区（Untranslated region, UTR）。基因组 5′端 2/3 的区域编码木瓜样蛋白酶（Papain-like protease, PLP）和 3C 样蛋白酶（Chymotrypsin-like protease,3Cpro）两个水解蛋白酶，水解产生 16 个非结构蛋白（Nonstructural proteins,nsp1~nsp16），后 1/3 的区域编码血凝素-乙酰酯酶糖蛋白（Hemagglutinin-esterase,HE）、纤突蛋白（Spike, S）、小衣壳蛋白（Envelope, E）、跨膜蛋白（Membrane,M）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）五个结构蛋白和几个辅助蛋白[29-30]。HE、S、E、M 蛋白位于病毒包膜表面，与病毒的装配和宿主细胞识别相关，HE 蛋白是 A亚群特有的蛋白，可介导病毒颗粒与 O-乙酰唾液酸的结合；S 蛋白与 HE 蛋白功能相似，是病毒的主要抗原位点并决定病毒组织或宿主噬性；E 蛋白和 M 蛋白主要参与病毒的装配过程[31]。N 蛋白位于病毒衣壳内，基因序列高度保守，包裹基因组形成核蛋白复合体，在病毒致病性、转录、翻译和复制方面起重要作用[29]。
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第二章 BPV VP1 蛋白抑制 IFN-β产生的分子机制
1 实验材料
1.1 细胞、质粒和病毒株
1.1 细胞、质粒和病毒株
2 实验方法
2.1 细胞复苏与培养
液氮罐中取出冻存细胞，置于温水中迅速摇晃使细胞冻存液快速融化，待融化后，低速离心机 300×g 离心 10min，75% 乙醇对细胞冻存管表面消毒，弃去冻存液，加入 1mL 培养基重悬细胞，后转入 T25 培养瓶中，添加 6ml 新鲜培养基，37℃、5% 二氧化碳培养箱继续培养。根据细胞生长状态，换液或传代。
细胞传代培养：细胞培养至密度达 80% 以上，即可进行传代培养。试验前，室温或 37℃水浴平衡培养基和胰酶，75% 乙醇对细胞瓶表面消毒 3 次。无菌条件下弃去细胞瓶中培养基，无血清培养基清洗 1 次，加入 1ml 胰酶，显微镜下观察，待大部分细胞不再贴壁，弃去胰酶，加入适量培养基，用吸管轻轻吹打细胞。根据试验安排将细胞悬液均匀分成几份，37℃、5% 二氧化碳培养箱继续培养。
2.2 BPV 毒株的培养与增殖
BT 细胞传代培养 6~8h，显微镜下观察，细胞培养至密度达 50~60%，弃去生长液，无血清 DMEM 培养基漂洗三次，以细胞瓶 1/10 体积的 BPV 毒液接种细胞，培养箱中孵育 2h，弃去多余毒液，加入适量含 2% FBS 的 DMEM 维持液，于 37℃、5% 二氧化碳培养箱中继续培养，逐日观察细胞状态，待细胞出现 CPE，细胞收于-80℃超低温冰箱。其后将细胞反复冻融 3 次，离心收集上清，-80℃保存备用。
2.3 BPV 病毒 TCID50 测定
BT 细胞铺 96 孔板，培养过夜，待细胞生长至 90%， 吸去生长液，用无血清DMEM 培养基轻柔洗三次，用无血清 DMEM 培养基将 BPV 病毒液作连续 10 倍的稀释，从 10-1~10-10。 将稀释好的病毒液接种到 BT 单层细胞上，每一稀释度接种一纵排共 8 孔，每孔接种 100µl，正常细胞对照作两纵排。接毒后于 37℃、5% 二氧化碳培养箱中培养 2h 后弃去毒液，换为含 2% FBS 的 DMEM 维持液，逐日观察并记录结果，Reed-Muench 两氏法判定结果。
表 2-1 引物序列信息
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第三章 BCoV N 蛋白抑制 IFN-β产生的分子机制...........................................27
1 实验材料.......................................27
1.1 细胞、质粒和病毒....................................27
1.2 主要试剂................................27
第四章 BCoV、BPV 单重 TaqMan qRT-PCR 方法建立............................. 37
1 BCoV 单重 TaqMan qRT-PCR 方法建立................................37
1.1 实验材料与方法...................................37
1.2 结果...........................................42
第五章 BPV 和 BCoV 双重 TaqMan qR T-PCR 检测方法的建立............... 53
1 实验材料与方法.............................................53
1.1 临床病料和病毒株........................................53
1.2 主要试剂及仪器...............................................53
第五章 BPV 和 BCoV 双重 TaqMan qRT-PCR 检测方法的建立
1 实验材料与方法
1.1 临床病料和病毒株
BPV Haden 株、BPIV 均购买自 ATCC。BCoV 阳性株由西南民族大学惠赠。BVDV NADL 株由甘肃省动物细胞工程技术研究中心保存。RABV 灭活疫苗由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。BHV、BAV、PEDV、BRV 均由生物医学中心保存。临床检测样本（59 份）为兰州市、张掖市部分牛场的犊牛腹泻粪便样品。
1.2 主要试剂及仪器
主要试剂及仪器同第四章 1.1.2。
1.3 引物和 TaqMan 探针的设计
本试验参考第四章建立的 BCoV TaqMan qRT-PCR 和 BPV TaqMan qRT-PCR 检测方法中的引物信息，进行引物、探针合成，引物序列见表 4-1 和 4-10。
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第六章 全文总结
1、BPV 非结构蛋白 NS1 蛋白显著（P<0.01）抑制 BPV 的体外增殖，结构蛋白 VP1蛋白极显著（P<0.001）促进 BPV 的体外增殖。
2、BPV VP1 可显著（P<0.01）抑制 VSV 介导的 IFN-β产生，可抑制 JAK/STAT 通路下游因子 Mx、OSA、ISG15、ISG56 转录水平的表达。
3、BPV VP1 可抑制外源关键因子诱导的 IFN-β的产生，同时可抑制 TBK1 和 IRF3（5D）诱导的 TBK1 及 IRF3 转录水平的表达。
4、BCoV N 蛋白可显著（P<0.01）抑制 VSV 介导的 IFN-β产生，且存在剂量依赖。
5、BCoV N 蛋白可抑制 MDA5、MAVS、TBK1 及 IRF3（5D）诱导的 IFN-β mRNA水平的表达。
6、BCoV N 可抑制 MDA5、MAVS、TBK1 和 IRF3（5D）诱导的 MDA5、MAVS、TBK1、IRF3 转录水平的表达。
7、本试验建立了以 BCoV N 基因、BPV VP1 基因为监测靶基因的单重 TaqManqRT-PCR 检测方法。8、本试验建立了以 BCoV N 基因和 BPV VP1 基因为监测靶基因的 BPV 和 BCoV 双重 TaqMan 荧光定量 qRT-PCR 检测方法。
参考文献（略）