疟疾分布广泛,是世界卫生组织确认的严重危害人体健康的寄生虫病之一｡广泛流行于热带和亚热带地区,在非洲国家以恶性疟为主｡卵形疟原虫首次被发现最有可能是1900年｡卵形疟分为2个亚种,2010年,Sutherland等将经典型命名为curtisi,变异型命名为wallikeri[4]｡过去,我国仅有少量卵形疟病例的报道｡近年来,随着国际交往的日趋频繁,重庆市外出务工人员的增多,输入性疟疾病例有逐年增多趋势,卵形疟病例也逐渐增多｡由于重庆市卵形疟原虫病例较少,很多实验室人员对较常见的curtisi亚种尚不熟悉,国内wallikeri亚种的报道则更为稀少,检测体系也不完善,容易导致漏诊或难以鉴别虫种｡现将我们在2015年发现的重庆市3例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种感染病例的实验室诊断鉴定情况报告如下,供同道参考｡
一､材料与方法
1标本来源及病例情况
标本为2015年重庆市3例输入性卵形疟原虫疑似病例的EDTA抗凝血｡患者1,男,30岁,曾在利比里亚打工,2014年7月曾在当地感染过疟疾,经治疗好转;2014年9月回国,2015年2月19日出现无明显诱因发热,2月26日在巴南区某个体诊所就诊按照上呼吸道感染治疗无好转,于2月28日前往重医附一院门诊就诊,实验室诊断为疟疾(未分型)｡患者2,男,49岁,2010前往安哥拉进行建筑工作,在安哥拉务工期间,曾多次患疟疾,患病期间未作疟疾虫种鉴定,只在当地职工医务室进行过青蒿素类注射治疗;2014年8月20日回国,回国至本次发病期间未出现任何疟疾临床症状;2015年6月5日患者突感发热､头痛,前往铜梁区疾控中心,RDT阳性,诊断为间日疟｡患者3,女,50岁,2012年前往坦桑尼亚务工,自述在坦桑尼亚感染过疟疾,服用抗疟药物后好转,2014年8月28日回国,2015年7月4日自觉有感冒､发热等症状,自行在附近药房购买退烧药等药物,对症治疗后无好转;7月13日到西南医院就诊,诊断为间日疟｡
2试剂与仪器
Giemsa染液购自珠海贝索公司;快速疟疾诊断试纸条(RDT)购自万孚生物技术公司;DNA抽提试剂是QIAamp DNA Mini Kit,购自QIAGEN;PCR反应混合物为Hot Start Green Master Mix,购自Promega;GleRed购自Biotium公司;PCR扩增仪购自美国ABI公司;凝胶成像系统购自BioRed公司｡
3方法
(1)厚､薄血膜镜检:按照WS259-2015附录B病原学检查方法,涂制厚薄血片,干燥､固定后Giemsa染色镜检拍照｡
(2)RDT检测:按照试剂说明书,吸取5μl全血样本滴加于加样孔A中,同时滴加4滴裂解液于加样孔B中,15min内观察显示的结果｡
(3)巢式PCR检测:依据国家参比实验室推荐,采用巢式PCR对疟原虫18s rRNA基因进行扩增｡第一轮采用疟原虫属特异性引物rPLU5和rP⁃LU6,第二轮采用4对疟原虫种特异性引物(rFAL1､rFAL2,rVIV1､rVIV2,rMAL1､rMAL2,rOVA1､rO⁃VA2),第二轮预期扩增产物长度分别为205bp､120bp､144bp､800bp｡
(4)卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR检测:采用NP-2002和NP-2005体系的引物(第一轮rPLU1和rPLU5,第二轮三对引物rPLU3和rPLU4､rPLU2和rOVA1､rOVA1v和rOVA2v),引物序列见表1,第二轮预期扩增产物长度分别为235bp､226bp､782bp｡
二､结果
1厚､薄血膜镜检结果
可查见各阶段疟原虫｡被寄生的红细胞颜色变淡有些被胀大,呈卵圆形或不规则形状｡滋养体期核较大,胞质较厚呈阿米巴阳伪足,空泡不明显,疟色素棕黄色｡裂殖体期红细胞稍有胀大,虫体成圆形或卵圆形,充满整个红细胞,裂殖子核较大,多为6~10个,排列不规则｡配子体约小于红细胞,呈圆形或椭圆形,细胞核1个,位于虫体的一侧或中间,疟色素散在｡
2RDT检测结果
3例血样均为质控和T2出现红色反应线,结果显示3例血样均为泛疟原虫阳性,即间日疟､卵形疟､三日疟单一感染或混合感染｡
3巢式PCR检测结果
3份血样采用4对疟原虫种特异性引物:恶性疟P.f(rFAL1､rFAL2),间日疟P.v(rVIV1､rVIV2),三日疟P.m(rMAL1､rMAL2),卵形疟P.o(rOVA1､rOVA2)扩增,电泳结果均为阴性｡
4卵形疟原虫wallikeri亚种的PCR检测结果
3份血样采用的针对卵形疟原虫wallikeri亚种的3对引物,扩增后电泳结果均为阳性,引物rPLU3和rPLU4扩增片段长度约为235bp,引物rPLU2和rOVA1扩增片段长度约为226bp,引物rOVA1v和rOVA2v扩增片段长度约为780bp,结果表明3份血样中的感染疟原虫均为卵形疟原虫wallikeri亚种｡
三､讨论
自2012年以来重庆市发现的卵形疟病例数呈逐年上升态势,2014年仅发现2例,2015年共发现卵形疟5例,其中2例为curtisi亚种,3例为wallikeri变异亚种,wallikeri变异亚种在重庆市是首次发现｡3例卵形疟wallikeri亚种患者分别自坦桑尼亚､安哥拉､利比里亚务工返回,都为有卵形疟流行的国家,且有境外疟疾感染史｡由于未进行规范的服药治疗,在国外时并未完全治愈,卵形疟与间日疟存在休眠期的子孢子,迟发型子孢子通过短则数月长则数年的休眠期后,开始发育,完成裂体增殖,引起发病,这也是输入性病例并未在归国入境的边检口岸查验出的原因｡
由于卵形疟与间日疟显微镜下形态特征很相似,加上未进行规范的服药,采血时间难以把握,基层镜检人员经验不足,其中有很多年轻镜检员没有实际经验,造成在医院就诊时3例患者中有1例未能分型,2例误诊为间日疟原虫｡因此应定期对镜检员进行培训及考核,特别是对少见的卵形疟､三日疟与间日疟虫种进行鉴别诊断｡
而且在重庆市部分基层医疗机构,显微镜老旧及质量不高也是严重影响镜检质量的重要因素,因此对不能达到使用要求的显微镜应尽早更新｡RDT检测虽然简便､快速,但是其对于卵形疟原虫的敏感性不高,虽然本研究中3例卵形疟原虫wallikeri亚种RDT结果为疟原虫阳性,但是国内仍有卵形疟原虫wallikeri亚种RDT漏诊的报道｡
用国家参比实验室推荐的巢式PCR方法检测,此3例结果均为阴性,结果显示引物rOVA1和rOVA2在检测卵形疟原虫wallik⁃eri亚种上存在局限性｡就此来说,每份血样同时进行镜检､RDT及分子生物学检测是非常有必要的,可以大大降低漏诊的可能性｡随着国内输入性卵形疟原虫wallikeri亚种病例报道的增多,国家参比实验室李美等设计并向各省推荐了改进的引物(第一轮rPLU5和rPLU6,第二轮UF:5'-CGACGG⁃TATCTGATCGTCTTC-3'和OR:5'-CAATA⁃CAACGTATCTGTTCTTTGC-3'),可以同时检测卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种,避免了wallikeri亚种的漏诊｡
随着输入性卵形疟原虫wallikeri亚种和诺氏疟原虫的发现报道,对于每个疟疾实验室检测技术人员都是新的挑战,不断学习新的知识,提高检测技术才能应对新形式下出现的新问题｡2012年底重庆市疾控中心获批筹建省级疟疾诊断参比实验室,从硬件和软件两方面加强了实验室核心能力建设,使疟原虫分型更加准确和细致｡
参考文献(略)