第一部分文献综述
1脑心肌炎病毒(EMCV)概述
不像其他病毒成员及其庞大，脑心肌炎病毒只是微RNA病毒科（PicoRnaviridae)，心病毒属（Cardiovirus)的唯一成员，根据分离来源的不同，有时也称哥伦比亚-SK (CoLumbia-SK)、小鼠脑脊髓炎病毒(MEV)、门哥（Mengo)病毒1945年在美国佛罗里达州，从一只患急性致死性心肌炎的黑猩醒体内，首次分离到EMCV，并在1958年在巴拿马首次证明导致猪死亡的病原体是EMCV，随后有报道，在世界上很多国家爆发和流行EMCV的彷主广泛，如喃齿类动物、某辟哺乳动物以及灵长类动物等，引起的急性传染病的主要特征为：脑炎、心肌炎以及心肌周围炎等。哨齿类动物巾的大鼠和小鼠是EMCV的自然宿主，感染后主要以脑炎而致死，并由鼠传播给其他动物，且当EMCV引起的脑心肌炎暴发时，氣类感染已较严重；哺乳动物中以猪对EMCV的敏感性最强，感染后多出现致死性心肌炎和心肌周围炎，处于妊源期的母猪大多出现死胎、弱胎、流产、木乃伊胎等繁殖性障碍，其他的表象中，健康猪多呈隐性感染[11-13]，据有关报道，猪脑心肌炎发病高的地区，人感染EMCV也较高[I4];灵长类动物中主以人类为主，人类被EMCV感染后，大多出现头痛、发热、精神姜靡、身体僵硬、呕吐等主要症状，有学者从患者和其他正常人群血清中检测到EMCV抗体，并从患脑膜炎和脑炎的儿童体内分离EMCV。
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1.2 EMCV的生物学特性
脑心肌炎病毒和其他部分小RNA病毒有着类似的组装结构和抗逆的理化特性，如常见口蹄疫病毒(FMDV)。病毒粒子呈圆形状，直径为20?30nm，无囊膜裸露的核衣壳，在CsCL中的浮密度为：1.34g/cm3,沉降系数为：156S，病毒粒子的衣壳为对称结构的二十面体，衣壳内含一单股正链RNA，3’端有poly A尾，5'端没有帽子结构，但有2kDa的小分子量蛋白VPg，蛋白衣壳是由4种不同的蛋白质构成的60个衣売粒子组装的，这4种蛋白质为：VP1、VP2、VP3、VP4(由VP2裂解的)；其分子量分别为：34、30、26、7kDa，该衣壳在CsCL中的浮密度为：1.33-1.34g/cm3。本病毒在甲酸、酸、84、电离福射条件下极易失活，在56°Clh能灭活，但对氣仿、乙醚、乙醇等脂溶剂以及SDS等去污剂有很张的抵抗力。在PH3?9时，EMCV稳定而不易失活，长期可保存于-70°C。鼠、猪、猴易感EMCV，但大多表现为隐性。宿主带毒后，经II便排到体外。通常情况下，致死性感染多发生于20周岁以内的幼龄动物，常见的为仔猪，隊可经非胃肠道或者口感染，5天左右死亡。在感染EMCV后，经3?5的潜伏期，就会出现短时间的发热，急性心肌炎等症状，有的还会出现精神萎靡，毛发粗糙而逆势，走路打颤而不稳，呼吸急促，之后不久就死亡，但多数无任何征兆而突然暴堯。剖检可见腔内冇积水，肝脾肿大，心脏多出可见白色斑点，直径在3?15mm，而且还有很多病理组织学检查的症状。EMCV能在仓鼠细胞系（BHK-21)、鼠胚成纤维细胞、非洲绿猴肾细胞(Vero)以及许多代肾细胞系等细胞培养物中生长和快速病变。EMCV有血凝性，通过血凝实验观察到其可凝集绵阳红细胞，针对该病毒的特异性抗血清可抑制该凝集反应、同柄毋株问的凝集反应的活性不一。EMCV只有一个血清型，由此，可建立相应的酶联免疫法（EUSA)检测相应的抗原或抗体。
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第二部分实验研究
第一章酶标抗原制备(EMCV-HRP)
收集96孔板中已病变的孔，反复冻融3次，3000rprn/niin离心lOmin，收上清去除细胞碎片，l0000rpm/min离心l0min,收上清去除大分子杂蛋白。参照总RNA提取试剂盒（离心柱型）操作步骤，提取EMCV涛液总RNA，操作如下：取上述EMCV毒液280miL于无蘭离心管(1 .SmL)，加入(裂解液)，充分均匀震荡，15-3°C放置6min，使得核酸蛋内复合物完全分离：吸入 220氯仿，剧烈霞荡 15，15-30°C 静置 3-4min，4°C, I3400xg、lOmin，吸上清于另一支离心管中；加入0.5倍(约35|aL)体积无水乙醇，充分混匀，液体全部移入吸附柱中，4°C，13400xg、Imin,弃离心废液；加入50(HiL去蛋白液RD，4°C，13400xg离心liiiin，弃离心废液；向吸附柱中加入 70(VL 漂洗液 RW，15-30°C静置 2min，4°C，13400xg, Imin,弃离心废液；加入 500iaL 漂洗液 RW, 15-3°C静置 2min，4V, 13400xg, Imin,弃离心废液；I3400xg, 2iTiin,去除残液，吸附柱静置5min,取汁，将吸附柱移入新的已做标记的离心管中，加入RNase-free ddH.0 60miL，4°C，13400xg, 2min。弃吸附柱，留离心液备用。
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2方法
在本实验室保存的细胞库中复苏一支vero细胞，操作如下：从液氮耀中缓慢取出已冻存的vero细胞，快速置于37°C水浴中，充分晃动，直至冻存管里融化成液体；将上述液体吸入50ml,细胞瓶巾，加入10%NBS DMEM培养艰1 0mL, WT37°C、5%C02培养箱中培养。48h后，弃上清，加少许胰蛋白酶消化片刻，弃胰蛋白酶，加10%NBS DMEM培养基缓慢吹打，稀释成40mL，铺96孔板。两天后，观察已铺的96孔板生长状况，当达到90%左右时，即可接毒。用无血清DMEM稀释EMCV(VR-129B株)，先10.1稀释后0.22m膜过滤除菌，再10—3, 10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10.1° 稀释备用。用无血清DMEM洗细胞已长到90%左右的96孔板3次，之后将稀释的毒液种到板中，100miL/L,置于37°C、5%C02培养箱中吸附2h。加6%NBS DMEM, 100 miL/L，使其终浓度达到3%，置于37°C、5%C02培养箱中培养观察。4天初判，7天后终判，依照Reed和Muench氏法计数TCIDso。
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第三章质量评价及初步应用........ 42
1 材料........ 42
2质量评价........ 43
2.1灵敏度验证........ 45
2. 2重复性验证........ 46
2. 3特异性验证 ........47
2.4稳定性验证........ 47
2.4. 1长期稳定性验证........ 47
2. 4. 2热加速稳定性验证 ........48
2.4.3运输稳定性........ 49
2. 5与间接ELISA法比较........ 50
3 应用........50
3. 样本处理........ 50
3.2 EMCV IgM捕获ELISA检测样本........ 54
3. 3双抗原夹心法检测样本........56
4结论 ........ 57
4. 1人EMCV IgM捕获ELISA方法的验证结果........ 57
4. 1. 4稳定性验证结果........ 58
4. 2与间接ELSA比较结果........ 59
4. 3样本检测结果........ 60
5小结与讨论........ 62
4结果
4. 1EMCV I gM捕获EL I SA方法的验证结果
人EMCVIgM捕获ELISA方法条件优化后，进行了验证，结果显示：能检测样本到1: 640； 3批试剂(包被板，其他试剂)的批内及批间变异系数均小予5% 只能检测人EMCV IgM抗体；板子和试剂可长时间放置和良好热稳定性；说明该人EMCVIgM捕获EUSA方法灵敏、精密、特异和稳定。在人EMCV IgM捕获EL1SA法的建立中，首先得确定包被的浓度，否则包被过高，会出现假阳性，过低会出现假阴性；其次是EMCV-HRP的工作浓度，EMCV-HPR变化很小的浓度，都会造成结果很人的变化，当EMCV-HPR的浓度高，会导致一些非特异性反应，过低会影响检测的敏感度。该法条件的优化是使用方阵滴定法，在此过程巾，除须优化的条件外，其余的其他条件都是f等杈准如：温度、酶标仪、PBST、移液枪、枪头等，不能随意更改。在做实验前，所有的试剂、包被板和样本，须提前置于室温(25°C左右）放置30min,以便实验准确减小误差；抗人IgMOi链)单抗开盖后须加50%的甘油，分装成若T支小管，-20°C保存，以便随吋取用，且避免反复冻融；在加样、配制EMCV-HRP工作液、PBST洗板、加AB液及终止液等，使用同一标尺和同一人操作，试验后测OD值前，须混匀反应液终止，且在酶标仪测量之前，选择合适的调零孔，测OD值；试验后，所有的废弃物须高压消毒后，方可弃之，以保证环境洁净和人的安全。
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结论
1通过PEG-6000浓缩和密度梯度离心获得了纯度较好的EMCV;并成功的进行了灭活和酶标记。
2初步建立人EMCV IgM捕获ELISA方法；制备了合适的阴阳性质控品。
3通过条件的优化和方法的验证，筛选出该法的最适条件；且该法灵敏、精密、特异和稳定，从而可以应用于实践的检测。
4经人EMCV IgM捕获ELISA法检测了 1077份人血，阳性率为：13.74%(148/1077),得知这批样本感染情况，从而确定预防和的治疗措施。
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参考文献（略）