第一篇 文献综述甲醛的毒性作用及修复机制的研究进展
甲醛是脂肪族一元醛类，广泛存在于汽车尾气、烟草烟雾和各种家居产品中[1,2]。2006年，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）评估认为甲醛是人类致癌物（A1组），可以导致鼻咽癌和白血病的发生，但具体机制尚不清楚[1]。甲醛不仅是一种常见环境污染物，也是一种内源性天然化合物存在于所有组织和体液中，参与嘌呤、胸腺嘧啶、氨基酸的合成和一些生物化合物的脱甲基等，从而维持细胞的正常生命活动。内、外源性甲醛在体内可以通过氧化、还原型谷胱甘肽（GSH）依赖的途径迅速代谢，然而当职业或环境暴露接触过量甲醛时，就会超过正常代谢能力，进而在体内蓄积，对组织、细胞造成一定的毒性损伤。
1 甲醛的理化性质
甲醛（Formaldehyde，FA），又名蚁醛，化学分子式为HCHO，相对分子质量为30.03，是一种无色有强烈刺激性气味的气体。比重为1.060，略重于空气，沸点为-21℃，易挥发。易溶于水、醇和醚，30％~40％的甲醛水溶液称为福尔马林，固态甲醛为三聚甲醛结晶，其聚合物受热后易发生解聚。甲醛具有正电性，它的羰基碳原子与两个氢原子相连，可发生亲核加成、氧化、还原、歧化等反应，是一种化学性质活泼的小分子醛类化合物。
2 甲醛的来源
甲醛的来源分为内源性和外源性两条途径。内源性甲醛由机体自然产生，是体内脂质的氧化或过氧化以及丝氨酸、甘氨酸、胆碱的代谢产物，这种天然的生物化合物存在于各种组织、细胞和体液中，维持着细胞的正常生命活动。一般认为，人血清中内源性甲醛的浓度为13~97 μmol/L[3]；外源性甲醛主要经呼吸道、消化道，也可经皮肤进入机体[4]。其来源有：（1）自然存在于水果和一些食物中的甲醛，这和它在哺乳动物中内生形成一样，由于氧化代谢而生成[5]；（2）机动车辆、电厂、焚化炉、炼油厂、木炭炉、煤油加热器的废气烟雾中的甲醛[6]；（3）建筑材料、室内装饰材料、化纤类纺织物、油漆、烹饪油烟、烟草烟雾中的甲醛；（4）消毒剂，尸体、组织标本的防腐固定剂。
3 甲醛的代谢
甲醛在体内代谢迅速，McMartinKE等人研究显示，甲醛在动物体内的半衰期仅为90s[7]，在体内迅速被相关代谢酶类代谢成为甲酸或进入单碳池与其它大分子结合形成一碳单位代谢物。甲醛代谢为甲酸过程中最主要的酶类为甲醛脱氢酶，甲醛在甲醛脱氢酶和其它酶的作用下通过辅酶Ⅰ（NDA）和还原型谷胱甘肽形成中间产物S-甲酰-谷胱甘肽，然后谷胱甘肽被释放形成甲酸。甲酸经代谢后，以CO2形式呼出，或以甲酸盐的形式从尿中排出，所以人体暴露于甲醛后，尿液中的代谢产物甲酸将增多，可以作为人体吸入甲醛的生物监测指标[8,9]。单碳代谢是许多生命活动的核心，甲醛可以进入“单碳池”，参与嘌呤、胸腺嘧啶、氨基酸的合成和一些生物化合物的脱甲基等，从而维持细胞的正常生命活动。在水溶液，甲醛可以转换为它的二醇形式，即亚甲基乙二醇 [CH2(OH)2]，与甲醛保持动态平衡。重要的是，亚甲基乙二醇，分子量只有48，可以轻而易举地渗入组织。因此，甲醛可以在血液中以二醇形式到达骨髓，在那里再次活化为甲醛[10]。
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第二篇 实验研究
第一章 甲醛对 BM-MSCs 的细胞毒性研究
甲醛（formaldehyde, FA）又名蚁醛，化学分子式为 HCHO，分子质量为 30.03，是结构最简单的一元醛类有机化合物，具有高挥发性和强烈刺激性气味。甲醛作为一种环境污染物广泛地存在于汽车尾气、烟草烟雾和各种家居装饰品中，对眼、呼吸、免疫、神经、内分泌系统具有明显毒性作用[1,2]。2006 年国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer, IARC）报告，甲醛是 A 类致癌物质，可以引起白血病的发生，但是生物学证据不足[1]。当人们持续暴露于外源性甲醛时，体内脂质的氧化或过氧化以及丝氨酸、甘氨酸、胆碱的代谢等还会产生内源性甲醛，这种天然的生物化合物存在于各种组织、细胞和体液中。内源性甲醛和它的氧化产物——甲酸进入“单碳池”，参与嘌呤、胸腺嘧啶、氨基酸的合成和一些生物化合物的脱甲基等，从而维持细胞的正常生命活动，Heck 等也证实甲醛在人血浆中的正常浓度为 13~97 μmol/L[3]。内、外源性甲醛在体内可以通过氧化、还原型谷胱甘肽（GSH）依赖的途径迅速代谢，然而当职业或环境暴露接触过量甲醛时，就会超过正常代谢能力，进而在体内蓄积，对组织、细胞造成一定的毒性损伤。甲醛易溶解于水和乙醇等溶液中，在水溶液中，甲醛转变成它的二醇形式，即亚甲基乙二醇 [CH2(OH)2] ，并且与其保持着动态平衡。重要的是，亚甲基乙二醇，分子量 48，可以轻易穿透到组织中。因此，甲醛通过其二醇形式随着血液可以到达骨髓，再转换回它的活性形式甲醛，从而对骨髓发挥毒性作用[4]。
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2 结果
2.1 甲醛对 BM-MSCs 增殖活性的影响
MTT 结果显示（见表 1），与对照组相比，BM-MSCs 经 25 和 50 μmol/L 甲醛作用 6，12 和 24 h 后增殖活性均无明显变化，作用 6 h后细胞存活率有轻微程度的升高，分别为 101.575 和 100.039，但无统计学意义（P>0.05）。当甲醛浓度≥75 μmol/L，作用 12 和 24 h 后，细胞存活率均显著下降，与对照组相比有统计学意义（P<0.01），并且呈浓度依赖关系；而当甲醛作用 6 h，只在≥150μmol/L时，细胞存活率明显下降（P<0.01）。另外，甲醛作用 12 h 和 24 h 的细胞活性变化不明显，无时间依赖关系（见图 1）。因此，我们选择 75~200 μmol/L甲醛作用12 h 的 BM-MSCs 进行后续实验。
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第三章 甲醛对 BM-MSCs 细胞周期和凋亡的影响及机制研究.......65
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞来源.........67
1.1.2 主要试剂.........67
1.1.3 主要溶液配制........68
1.1.4 主要仪器.........70
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和处理....70
1.2.2 流式细胞术检测细胞周期.........71
1.2.3 鬼笔环肽（phalloidine）/hoechst33258 双染检测细胞凋亡.........72
1.2.4 western blot 检测凋亡相关蛋白的表达情况.........73
1.3 统计学分析.........75
2 结果
2.1 甲醛对 BM-MSCs 细胞周期的影响........75
2.2 甲醛对 BM-MSCs 凋亡的影响.........78
2.3 甲醛对细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响.........84
3 讨论........86
4 小结........90
第三章甲醛对 BM-MSCs 细胞周期和凋亡的影响及机制研究
细胞周期和凋亡是细胞生命活动的两个重要进程。细胞周期是从细胞分裂结束开始，到下一次细胞分裂结束为止的过程，包括 DNA 合成前期（G1 期）、DNA合成期（S 期）、DNA 合成后期（G2 期）和细胞分裂期（M 期）。正常的细胞周期中有两个关键调控点以确保细胞周期能有序的进行，一个发生在 G1/S 转换期，调控 DNA 复制的开始，另一个位于有丝分裂和细胞分化前的 G2/M 调控点。细胞分裂周期的调控是一个复杂的生物学过程，几乎所有的癌基因、抑癌基因均能直接参与细胞周期的调控，或者本身就是细胞周期调控复合体的主要成分[59]。如果细胞周期调控机制受到破坏，可导致细胞生长失控、分化受阻[60]。国际癌症研究机构已经将甲醛列为人类可能致癌物，但有关细胞周期的研究报道很少。于光艳等人研究发现，甲醛可以诱导骨髓细胞发生 S 期阻滞[61]。然而李兰等却发现气态甲醛动态染毒使雄性小鼠的骨髓细胞发生 G2 期阻滞[62]。细胞凋亡又称程序性死亡（programmed cell death, PCD），是指为了维护内环境的稳定而由基因控制的细胞自主有序的死亡。国内外关于甲醛在细胞凋亡中的诱导作用已有不少报导，如 Sandikci 等研究大鼠吸入甲醛，可引起肺组织的支气管淋巴组织细胞凋亡的数量增加[13]；Nie 等人研究甲醛诱导形成的 tau 淀粉样聚集物可以诱导 SY5Y 神经瘤细胞凋亡[14,15]；王寿云等研究发现，长期处于高甲醛的室内环境中可使睾丸和生精细胞发生凋亡[16]；何胡军等研究发现甲醛可诱导Hela 细胞凋亡等[17]；但是甲醛诱导凋亡的作用机理还不甚清楚，有待于进一步研究。
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结论
ERK 激酶在启动凋亡的同时，又是某些 DNA 损伤诱导的 G2/M 期阻滞所必需的；最近，又有一些强有力的证据证明 p53与 ERK之间互相调控。Marchetti A研究发现 p53能够通过 caspase 介导的 ERK2/MAPK 的细胞裂解通路来抑制细胞增殖，他们发现刺激 Ras/MAPK 级联不但可以激活 P53 和促进细胞衰老和凋亡，也可以降低P53 和促进细胞存活[90]。在 Ras 基因转染细胞中，细胞阻滞是由 P53 蛋白诱导的，并且与 ERK2 的活性、磷酸化水平和蛋白质半衰期的大幅度降低有关，并且有caspase 的活化出现。除此之外，caspase 的抑制物或耐 caspase 的 ERK1/2 基因突变产物的表达会干扰 EPK1/2 的降解，并在 P53 存在的情况下仍然可以进行细胞增殖，表明了 caspase 介导的 ERK1/2 的降解促成了 P53 诱导的生长阻滞。因此，要确定具体哪条信号通路参与了甲醛诱导的 G2 期周期阻滞和细胞凋亡，还需进一步深入研究。综上所述，我们认为 P53、Chk1、ERK1/2、Bax 和 Bcl-2 共同参与了甲醛诱导 BM-MSCs 的 G2 期周期阻滞和细胞凋亡。
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参考文献（略）