前言
慢性乙型肝炎是长期以来烕胁中国人民生命健康的一个重要的因素。现有的研究表明，慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌是一个连续的病理生理过程。中国的慢性乙型肝炎病毒携带者数量在一亿左右，每年每十万患者中因慢性肝炎肝硬化死亡者为24.5,因肝细胞肝癌死亡者为14.5[1]。近年来，随着预防接种的普及，乙型肝炎病毒的感染率有了明显的下降，但仍处在相当高的水平，在某些地区尤其居高不下[2]?因此，对于慢性乙型肝炎患者，肝硬化和肝癌的早期诊断显得尤为重要。随着基因技术、蛋白质组学、肿瘤学、免疫学方面的研究进展，发现了一系列的肝癌标记物，其中AFP和GP73被认为是最可靠的肝癌标记物[3]。然而，对于早期肝硬化而言，目前没有非常可靠的血清标记物，肝纤维化和肝硬化的诊断金标准仍然是组织学检查。这种方式对肝纤维化与肝硬化的程度能反映地比较准确，但肝组织活检是有创检查，不能广泛应用，患者在接受肝穿刺活检时难免存在顾虑；而且难以反复取材监测病情的动态变化，不能预测病变的发展[4]。因此，研发一种新的诊断肝纤维化程度的血清学指标成为目前迫切的需求。CK18属于细胞角蛋白家族，是正常细胞骨架的构成成分，在多种上皮细胞中均有表达；人肝细胞中仅表达CK18与CK8。在正常的生理情况下，肝细胞调亡与再生保持着一个动态平衡，以维持器官的功能；而在病理情况下，这种平衡被打破，其机制包括肝细胞坏死与调亡。研究表明，多种慢性肝病，包括慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化与肝硬化、肝细胞肝癌中，都会引起肝细胞坏死与凋亡的显著增加[5]。
肝细胞的凋亡机制比较复杂，其启动主要包括含半胱氨酸的天冬氣酸蛋白水解酶(caspase)的激活。其中caspase-2, -8, -9，-10首先被激活，然后由这些酶继续激活下游的caspase-3，-6，-7[6]。CK18在肝细胞凋亡过程中的具体意义尚不明确，但已有研宄显示CK18被caspase水解的过程能够促进调亡小体的形成，放大调亡信号，引导下游的级联反应[7]。体外和体内实验己经证实，当肝细胞发生坏死或凋亡时，CK18被释放入血，使得血清中CK18含量升高[8]。其中肝细胞调亡时，CK18在其氨基酸序列的第238-396位点被特异性地裂解为CK18片段[9]。M30抗体能特异性地识别裂解片段的第387-396位点之间的一段短肽，故又称CK18-Asp396。这种特异性的裂解片段可以被M30抗体单独检测出来；总的CK18可以被M65抗体检测出来。肝海绵状血管瘤本质上是局部的血管畸形、血流动力学紊乱的病变，并不涉及到肝脏炎症、肝细胞的破坏或恶变，目前对肝海绵状血管瘤的诊断没有可用的血清学标记物[iG]。因而我们可以认为，单纯的肝海绵状血管瘤患者应该并不存在CK18较正常人群的升高，所以我们的研宄能够将肝海绵状血管瘤患者作为正常对照，来对比慢性乙型肝炎后肝硬化合并肝癌的患者的CK18水平及其动态变化。CK18与慢性乙型肝炎后肝硬化以及肝癌的关系已经得到了初步的关注,但CK18在这一病理生理过程中的具体意义以及和CK18对肝纤维化、肝硬化的诊断价值尚无系统研究报道。
…………
实验材料
1. 人血清样本
在北京协和医院肝脏外科病房的符合条件的患者身上采集，均为常规检查之后剩余的血样。
2.试剂盒
(1)瑞典PEVrVA公司生产的M65 ELISA试剂盒；
(2)瑞典PEVrVA公司生产的M30 Apoptosense ELISA试剂盒。
3.耗材
各种型号离心管、枪头均购自江苏省海门市碧云天生物技术研究所。
4.主要仪器和设备
超净工作台 苏州净化设备有限公司
台式高速离心机 TGL-16G
全自动酶标仪 瑞士哈美顿公司
……….
实验材料....... 13
实验方法...... 14
实验结果...... 18
讨论...... 34
总结与展望...... 48
讨论
慢性乙型肝炎是长期以来威胁中国人民生命健康的一个重要的因素。现有的研究表明，慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌是一个连续的病理生理过程。中国的慢性乙型肝炎病毒携带者数量在一亿左右，每年每十万患者中因慢性肝炎肝硬化死亡者为24.5，因肝细胞肝癌死亡者为14.5。近年来，随着预防接种的普及，乙型肝炎病毒的感染率有了明显的下降，但仍处在相当高的水平，在某些地区尤其居高不下[2]。由于慢性乙型肝炎后肝硬化与肝癌的发生与进展都很隐蔽，在确诊时往往己经难以挽回，导致肝硬化与肝癌的预后很差[11]。因此，对慢性乙型肝炎后肝硬化、肝癌的早期诊断十分重要。一.HCC血清标记物的研究进展对于慢性乙型肝炎病毒感染者，现有的肝癌早期诊断的手段主要是肝脏超声检查与AFP的联合应用，这是一种非常好的手段，早在1997年，在我国进行的一项大规模的前瞻性研究已经证实了这一点：17920例慢性乙型肝炎病毒感染者随机分成了超声+血清AFP检查的规律监测组(n-8109)与对照组(n=9711)，进行了平均14.4个月的随访观察，规律监测组中发现了 38例肝癌患者，对照组发现了 18例。在监测组中有24例符合手术指征，术后2年生存率77.5%;对照组中无一例有手术指征，1年后这18例患者全部去世[12]这项研究以及此后的其他多项研究都充分说明了 AFP是肝癌早期诊断的非常好的血清学指标。
…………
总结
本研究通过观察慢性乙型肝炎后肝硬化合并肝癌的患者和肝海绵状血管瘤患者的CK18在术前术后的动态变化，初步阐明了以下几点：
1.证实了慢性乙型肝炎后肝硬化和肝癌的患者术前的血清总CK18与CK18裂解片段水平均高于正常；
2.首次发现了在慢性乙型肝炎后肝硬化和肝癌的患者中，肝癌可能是引起血清CK18升高的因素中更主要的方面；
3.首次证实了手术损伤能够引起血清CKIS升高，这与CK18在肝细胞破坏中的机制是相符合的。此外，本研究还发现，血清CK18在术后第五天能够降至接近术前水平，而ALT在术后第五天仍显著高于术前水平；这提示CK18可能有着比ALT更短的血装半衰期，这一点尚无文献报道，是首次发现。这一点发现的意义在于，在体内如果没有持续的肝细胞损伤产生新的CK18,则血清中CK18水平能够很快下降，这对于监测疾病的活动情况、判断用药效果都有很大的帮助。
…………
参考文献（略）