第一部分重组腺病毒介导的角化细胞生长因子表达载体构建
1.1研究背景
基因治疗定义为“以基因转移治疗人类疾病为目的的治疗方法，包括新的遗传物质转移以及现有的遗传物质的修饰”[77]。基因治疗能针对目的细胞而不会影响其它正常细胞。分子生物学的最新进展证明基因治疗在许多疾病的治疗中都能发挥作用。基因疗法已用于许多人类疾病的早期临床试验，并显示了很大的治疗潜力。腺病毒载体是近年来常用的基因治疗的主要载体之一。应用于基因治疗的腺病毒主要是基因修修饰后的腺病毒C血清型的2和5亚型。腺病毒（Ad)有一个正二十面体蛋白衣壳，约36,000个碱基对的线性双链DNA基因组[78]。蛋白衣壳上大约十几种的衣壳蛋白，无脂质包膜，其基因组能编码约35种蛋白。其编码的蛋白具有调节功能，使病毒获得有主细胞的主导权，并进行病毒DNA的复制。病毒颗粒组装在开始于感染1天后的细胞核内，并在几天后细胞裂解，释放感染性的病毒，感染细胞能产生约10,000子代病毒颗粒。人腺病毒有至少有57个血清型，Adl-Ad57 [65, 79]。人腺病毒无处不在，大多数人都感染了一个或多个血清型的腺病毒，并终身免疫。腺病毒感染可无症状，或可导致疾病，通常是免疫能力低下时发病，Adl，2, 5, 6血清型是最常见的。
……….
1.2材料与方法
(1)生物安全柜 Thermo Foma公司，美国
(2)电动摇床 KylinBell公司，中国
(3) Olympus 1X70倒置相差显微镜 Olympus公司，日本
(4) DK-8D电热恒温水浴箱 上海医用恒温设备厂，中国
(5)电子天平 Sartorius公司，德国
(6) NanoDropND-1000紫外/可见光光度计 Thermo Fisher公司，美国
(7)低温高速离心机 Eppendorf公司，德国
(8) Forma - 80 °C低温冰箱 Forma公司，美国
(9)西门子-20 V冰箱 Siemens公司，德国
(10)AKlOO制冰机 Scotsman公司，意大利
(11)移液器 Eppendorf公司，德国
(12)超纯水系统 Sanoius公司，德国
(13)C0:2细胞培养箱 Thermo Forma公司，美国
(14)Vortex振荡器 SI公司，美国
(15)恒温细菌培养箱 Thermo Forma公司，美国
(16)恒温水平摇床 常州科迈实验仪器有限公司，中国
(17)Olympus DC 81焚光显微镜 Olympus公司，日本
(18)小型台式离心机 Sigma公司，德国
(19)细胞活力计数仪 Beckman Coulter公司，美国
………
第二部分腺病毒重组角化细胞生长因子生物活性分析
2.1研究背景
角质细胞生长因子（KGF，或成纤维细胞生长因子-7，或FGF-7)是促细胞分裂和细胞快速增长的FGF家族的成员[94，95],是与表皮细胞创伤修复再生的一个重要的生长因子。研究表明，其KGF可以在体内和体外保护受刺激皮肤的上皮细胞[96-98]。KGF由真皮成纤维细胞分泌，通过上皮细胞表面的受体刺激角质形成细胞增殖。KGF基因在损伤的急性期表达增加，可以加速清理和修复受损组织。KGF在人体皮肤表达较弱，但皮肤损伤后强烈上调在皮肤成纤维细胞[99]。研究表明在热损伤组织中该基因被上调，平均125倍于皮肤成纤维细胞和7.5倍于从烧伤患者伤口中分离的角质形成细胞的表达量。真皮成纤维细胞KGF基因表达的细胞因子信号后也通过角质细胞的受体而增大[100]，KGF表达在损伤后会增加[28],而上皮的修复依赖于KGF促有丝分裂的能力。KGF以旁分泌的方式刺激伤口表皮细胞再生。KGF受体信号传导阻断与伤口愈合异常有关[28, 99]。KGF具有广泛的生物活性，有效促进角质形成细胞分裂，且是高度特异性的[94]。与其他FGF成员相比，KGF特异性作用于各种组织中的上皮细胞，如肺泡上皮细胞[101],肝实质细胞[102],胃肠细胞[103]，泌尿道上皮细胞[104]，以及各种鳞状上皮细胞[105]。除了其促有丝分裂作用，KGF已确定为对于不同类型的上皮细胞在体外和体内一种强的存活因子，从各种刺激中保护这些细胞[106]。KGF的第一个临床药物Palifermin已被FDA批准用于治疗口腔牲膜炎。另外KGF也很可能应用于慢性肝损伤[102]，肝再生[107],糖尿病伤口愈合[108]，急性肺损伤[109],和胎儿肺发育不全[110]等。
…….
2.2材料与方法
(1)生物安全柜 Thermo Foma公司，美国
(2)电动摇床 KylinBell公司，中国
(3) Olympus 1X70倒置相差显微镜 Olymims公司，日本
(4) DK-8D电热恒温水洛箱 上海医用恒温设备厂，中国
(5)电子天平 Sartorius公司，德国
(6) NanoDrop ND-1000紫外/可见光光度计 Thernio Fisher公司，美国
(7)低温高速离心机 Eppendorf公司，德国
(8) Forma - 80 °0低温冰箱 Forma公司，美国
(9)西门子-20 °C冰箱 Siemens公司，德国
(10)AKlOO制冰机 Scotsman公司，意大利
(11)ABI 7500 定量 PCR 仪 AppliedBiosystems 公司，美国
(12)移液器 Eppendorf公司，德国
(13)超纯水系统 Sanoius公司，德国
(14)C02细胞培养箱 Thermo Forma公司，美国
(15) Vortex 2振荡器 SI公司，美国
(16)恒温细菌培养箱 Thermo Forma公司，美国
(17)恒温水平摇床 常州科迈实验仪器有限公司，中国
…….
第三部分大鼠皮瓣坏死创面愈合模型的建立.........38
3.1研究背景 .......38
3.2材料与方法....... 40
3.3实验结果....... 45
3.4 结论....... 47
第四部分腺病毒重组角化细胞生长因子载体.......50
4.1研究背景 .......50
4.2材料与方法...... 53
4.3实验结果....... 59
4.4讨论....... 66
4.5结论....... 69
第五部分表皮生长因子和血管内皮生长因子联合用药.......70
5.1研究背景 .......70
5.2材料与方法....... 71
5.3实验结果....... 75
5.4讨论....... 83
5.5结论 ....... 84
第五部分表皮生长因子和血管内皮生长因子联合用药促进大鼠背部皮瓣坏死创面愈合
5.1研究背景
前文中，我们在能高效表达KGF的载体作用下，大鼠背部随意皮瓣坏死创面愈合加速。在这种皮瓣坏死创面中，不通过载体直接给药是否能取得治疗效果，是否存在其它益于坏死创面愈合的药物呢？表皮生长因子（EGF)，是由Cohen第一次从小鼠颌下腺中分离得到[40],是已知的各种细胞，包括角质形成细胞，成纤维细胞和iL管内皮细胞的增殖强效刺激刻[41-44]。EGF剌激角质形成细胞的迁移，并刺激成纤维细胞和血管内皮细胞生长，促进肉芽组织的形成[45-48]。一系列的实验和临床研究巳证实EGF对皮肤伤口愈合，包括炎症，伤口收缩，增殖，迁移和血管生成有积极的作用[49-53]。EGF可刺激成纤维细胞合成的肝细胞生长因子（HGF)，也可促进伤口的血管生成。血管内皮生长因子（VEGF)是已被证明能作用于特定的受体系统，是业管生成的基本调节因子。血管内皮生长因子的受体仅见于内皮细胞，能强效促进血管内皮生长[57]。外源性VEGF通过动脉内和皮下注射给药可以提高随意皮瓣和岛状皮瓣缺iL性损伤后的存活率。VEGF通过使血管化充分，有助于组织生长，减少缺血。在术前，皮下给药VEGF可诱导血管生成，提高腹直肌皮瓣皮岛的生存率[165]。VEGF可以改善肌肉皮瓣、缺血皮瓣的成熟和生存，它能够减少因缺血再灌注损伤而引起的血管内皮功能障碍[58, 166]。有充分的喊齿动物实验证明，通过基因编码的人血管内皮可以改善皮瓣存活率。
………..
结论
我们已经证明，皮下注入EGF和VEGF可以辅助坏死伤口愈合。EGF + VEGF组组织切片结果显示角质形成细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞增殖明显，促进了大鼠皮瓣坏死区愈合和改善坏死区域的组织结构。因此，EGF + VEGF具有促进坏死伤口愈合的潜力。其作用机制可能是血管内皮生长因子改善的血液供应和EGF刺激伤口边缘表皮增生。Masson染色结果显示EGF组和EGF + VEGF组都有明显的纤维组织成分形成，组织排列有一定的方向性。PBS组和VEGF组染色见纤维成分少于另外两组。免疫组织化学anti-CD34血管内皮细胞染色显示，EGF,VEGF都有明显的血管内皮促进作用，组织内还可见较大管腔血管形成。这说明EGF, VEGF有利于坏死创面伤口的愈合和组织结构的改善优化。我们没有检测到四组血液中，虽然表达水平于术后5日和10日明显上升，但EGF和VEGF没有差异。这可能是因为机体受刺激后自分泌EGF和VEGF。我们的注射EGF和VEGF并没有进入循环系统。在今后的研究中，还可运用其他载体的基因治疗系统进行研究，以推动更多的坏死创口的治疗研究。
…………
参考文献（略）