第一部分Tespal通过调控TCR信号参与胸腺细胞的发育
1引言
T细胞在胸腺中的发育需经历从造血干细胞分化，谱系定向一直到阳性选择和阴性选择等一系列阶段。多能造血干细胞在骨髓中分化为定向干细胞，其中包括淋巴样干细胞，其中一部分前T细胞经血液循环迁移到胸腺成为未成熟的CD4_CD8_a阴性胸腺细胞(进一步可以分为DN1-4四个阶段)，然后经历CD4+CD8+(DP)双阳性胸腺细胞，最后成为成熟的CD4+或者CD8+单阳性T细胞、这个过程的后期发育阶段需要T细胞抗原受体（TCR，T-cellreceptor)的表达以及活化。比如，DN3阶段之后的发育依赖于TCRP链的成功重排，以及TCR前体提供的信号，而DP到成熟SP的发育依赖于apTCR的表达和阳性选择。最终只有一小部分能表达功能性TCR的DP胸腺细胞，能通过识别自身抗原肽，进而成功完成阳性选择2，3，4。阳性选择成功的细胞会进入胸腺髓质区，进行阴性选择，以别除和自身抗原高亲和力结合的自身反应性T细胞。胸腺中微环境以及胸腺基质和树突状细胞上MHC递呈的抗原肽的属性很大程度上决定着TCR信号的强度和持久性，进而影响阳性选择、阴性选择和谱系定向分化4。当TCR被激活后，Src家族激酶Lck碟酸化TCR受体复合物中CD3分子的ITAM酪氨酸基序，磷酸化的ITAM基序随后招募和活化Zap70。活化的Zap70又接着楼酸化接头蛋白LAT，促使LAT信号复合体形成,这个复合体包括了 PLC-yI，Grb2, Vav, Gads, SLP-76和Themis等信号分子5，气这些信号分子被招募到复合体后，促使了.酸脂酶PLC-yl的活化，PLC-yl可催化PIP2生成胞内第二信使DAG和IP3，其中IP3可使细胞内每库的Ca2+释放到胞浆，活化Ca2+-NFAT信号通路，而DAG能激活蛋白激酶C，开启了下游MAPK信号的级联活化。这些TCR信号对胸腺细胞的存活，分化和成熟至关重要7，8，9，iG。敲除这些参与TCR信号的分子，如Lck, Zap70, Tec家族激酶和Erk等，都会导致胸腺细胞的发育障碍。
虽然许多调节TCR信号和胸腺发育的分子已经被报道，但是我们对这些分子之间的相互关系以及信号复合体如何组装仍然不是十分清楚。我们这里描述了一个之前来被报道的参与胸腺细胞阳性选择和TCR信号的新星分子Tespal。Tespal是一个含有458个氨基酸的未知功能蛋白，在脊推动物中序列相当保守。我们发现Tespal不仅在胸腺T细胞中高表达，而且随着T细胞发育的进程而改变，在DP阶段达到最高表达水平，预示其可能在这一发育阶段起调控作用。事实上，我们发现Tespal的缺失会导致胸腺细胞DP阶段的阳性选择受阻，使胸腺中CD4+和CD8+单阳性细胞大量减少。我们用进一步的实验证实Tespal是TCR信号复合体的重要组成分子之一，且能通过调节TCR信号体的组装调节胸腺T细胞的发育。
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2材料和方法
2.1实验材料
生物安全柜（Healforce)
细胞培养箱(Thermo scientific)
-80°C超低温冷藏柜（Eppendorf,PREMIUM U410 UPRIGHT FREEZER)
电热恒温鼓风干燥箱(GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）
液氮生物容器（Cryosystem 4000,MVE)高速离心机（Beckman)
冷冻离心机(Thermo scientific,HERAEUS FRESCO 17)
台式高速离心机(Thermo scientific)
祸旋仪高压蒸汽灭菌锅(HVE-5 0，Hirayama)
电热恒温水浴槽(DK-8D型，上海精宏实验设备有限公司）
多功能混匈仪纯水仪（Thermo scientific Bamstead,NANO pure Diamond)
倒置显微镜(Olympus)
酶标仪(ABI)
PGR 仪(Applied Biosy stems,V eriti)
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2.2实验方法
2.2.1细胞培养
2.2.1.1 准备
1)生物安全柜提前打开紫外灯灭菌，培养基预热（注意：进入操作台所用物品已灭菌处理）
2)细胞用培养基配制：293T— DMEM + 10%FBS +1% 抗生素Jurkat—1640 + 10%FBS + 1% 抗生素
2.2.1.2细胞复苏
1)细胞株从液氣中取出后，立刻放入37°C水洛中迅速解冻。
2) HOOrpm离心5min去除上清液，将细胞用培养液重悬并转移至细胞培养皿中，置于rrc、5% (v/v) CO2培养箱内培养。3)培养过夜，次曰观察确定复苏是否成功。
2.2.1.3细胞
1)显微镜下观察细胞，当细胞密度约80%时传代增。
2)贴壁细胞的传代，吸弃培养基，PBS洗一遍。
3)加入少量胰酶（覆盖细胞即可），静置培养皿消化Imin左右细胞即可脱落。
4)加入2ml培养基中和胰酶，轻轻欢打混句液体，将液体转移到离心管内，1400rpm，离心 5min
5)弃去上清液，加入4mllxPBS重悬洗淥细胞，1400rpm离心5min，以除去残留JlL h-fc jjcAr的酶。
6)弃去上清液，加入新鲜培养基重悬细胞，按照需要浓度接种到细胞培养皿中，再加入足够培养基，轻轻混匀使细胞均句分布至平皿内，放入恒温培养箱中(5%co2v/v)继续培养。
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第二部分Tepsal负向调控肥大细胞FesRI信号.......... 78
1引言.......... 78
2实验材料和方法 ..........80
2.1实验材料.......... 80
2.2实验方法.......... 80
3实验结果.......... 83
4讨论与小结.......... 117
第二部分Tespal负向调控肥大细胞FcsRI信号和肥大细胞介导的过敏反应
1别言
Th2型免疫反应主要参与抵御环境中的异物或者寄生虫。但在环境中非感染的过敏原存在的情况下，这种应答也可以导致过敏反应，产生有害的症状，如瘙痒或者炎症或者更严重的造成组织损伤。就目前所知而言，肥大细胞在过敏反应中居于一个核心地位1’ 2。活化的肥大细胞通过释放颗粒中预先合成的化学介质，并产生多种细胞因子和趋化因子，以及分泌新合成的花生四烯酸和各种蛋白质从而促发过敏反应1’ 3。肥大细胞主要通过IgE和特异性Fc受体FcsRI识别抗原。多价抗原与FcsRI受体上的IgE相结合，从而引起受体的交联，进而引发肥大细胞的活化4’5。FcsRI在肥大细胞的表面以四聚体的形式存在，包括一个与IgE结合的a亚基，一个具有信号调节功能的P亚基和两个传递信号的Y亚基气FceRI被激活后，将导致P和T亚基胞内段的保守序列ITAM基序被快速填酸化，这个过程是Lyn依赖性的。然后另一激酶Syk被招募并结合于.酸化的ITAM上，然后导致下游主要信号通路Grb2/PLC-Yl/SLP-76被激活9,最终导致下游MAPK，PKC和甸离子流被激活。
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小结
在这一部分工作中我们发现Tespal能负向调控FcsRI介导的肥大细胞活化和过敏反应。Tespal的缺失虽然不影响肥大细胞的发育，但是却使其不论在体内还是体外都对FcsRI的剌激具有高敏感性。FcsRI介导的肥大细胞活化可以被许多抑制机制所负向调节。参与FcsRI信号的内部分子可以精细的负调节肥大细胞激活过程，这对防止过度的炎症和过敏反应至关重要。例如Lyn激酶被认为是肥大细胞活化所必须的，它能碟酸化多种关键蛋白，但是Lyn也能通过和另一激酶Fyn或者激活碟酸酶SHIP-1从而负调控FcsRI信号8。LAT和NTAL的信号体的平衡也能决定FcsRI信号。LAT和NTAL都能被上游的路氣酸激酶所填酸化，然后能为下游一些蛋白提供锚定的区域，如Grb2和Gab2。我们的结果提示Tespal能够和NTAL有优先结合，从而促进其他信号分子与NTAL相结合；当缺乏Tespal之后，信号分子Grb2，PLOyl和SLP-76等变被转移至LAT，产生更多的结合，从而导致LAT信号体的过度代偿。同时NTAL上空出的错定区域也可以招募更多的Gab2和PI3K,这两个蛋白能促进肥大细胞中补充信号通路，从另一方面解释了我们观察到的Gab2的.酸化增强和补充信号通路信号增强。而且一些癖酸酶如SHIP1可能也在这一过程中起到了一定作用。
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参考文献（略）