第 1 章 文献综述
1.1 隐孢子虫的研究进展
隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种重要的人兽共患寄生性原虫，主要引起人和动物的呼吸道以及消化道疾病，宿主范围广泛，可以感染包括人在内的约 240种动物，可以通过食物，饮水，空气等多种媒介进行传播，可以引起免疫力低下的人群和儿童发生严重的腹泻等胃肠道疾病，对动物则是导致幼禽产生呼吸道和消化道疾病，对幼畜导致消化道疾病，甚至会导致死亡[1]。世界著名的寄生虫学家 Tyzzer 于 1912 年在小鼠的小肠中首次发现隐孢子虫，由于是在小鼠体内，因此当时 Tyzzer 将其命名为小鼠隐孢子虫（Cryptosporidiummuris）。隐孢子虫的卵囊一般为椭圆形或圆形，直径大约为 4-6 μm，在成熟的卵囊中有 4 个子孢子和残留体。观察子孢子和残留体可以发现，子孢子基本呈现为月牙形，而残留体则有一个空泡和一些颗粒状物质组成。采用改良抗酸染色法对隐孢子虫卵囊进行染色，镜下可以看到卵囊被染成了玫瑰红色或暗红色，而背景染成了蓝色，卵囊内的子孢子呈不规则排列。目前，禽类隐孢子虫分布比较广泛，禽隐孢子虫的寄生宿主不仅可以在鸡，鸭等家禽体内分离到，还可以在野生鸟类等几十种动物体内分离得到；其公认的有效种有 3 个，分别是鸡隐孢子虫（C. galli），贝氏隐孢子虫（C. baileyi）和火鸡隐孢子虫（C. meleagridis）；鸡隐孢子虫的卵囊为圆形或椭圆形，它的壁比较薄而密，没有微孔和极粒，大的卵囊可达到 6.8 μm×6.5 μm，小的则为 4.1 μm×4.0 μm；在卵囊中央有 4-5 个颗粒，呈暗色，或者一些点状折光物；火鸡隐孢子虫的卵囊一般为球形，大概有 5 μm 左右，它也有 4 个子孢子，呈长形；贝氏隐孢子虫卵囊为球形或椭圆形，里面包有 4 个类似香蕉的子孢子和一个残体，贝氏隐孢子虫的卵囊壁比较光滑，没有颜色，同样没有微孔和极粒，一个比较大的折光体位于近颗粒残体中间部分[2]，贝氏隐孢子虫一般寄生在泄殖腔，法氏囊和气管粘膜表面，带状空泡呈图钉状镶嵌在粘膜表面的微绒毛丛中，子孢子和裂殖子的头部比较尖，尾部则比较圆，贝氏隐孢子虫从卵囊中逸出后，在宿主法氏囊等的粘膜表面进行运动，从而找到钻入宿主的部位，随后以头部垂直侵入粘膜上皮细胞的方式进入，而在这一过程中，虫体的形态由香蕉形变成鼓槌形[3]。
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1.2 隐孢子虫转染的研究进展
转染技术（Transfection）是指将外源基因组 DNA 导入到真核细胞内，并能够在细胞内进行表达的一种技术，一般来说，转染技术可以分为两大类，一类是稳定转染，另一类叫做瞬时转染，稳定转染是指外源的基因 DNA 可以整合到宿主的染色体中，但也可以作为一种游离的状态存在；瞬时转染则是指外源基因不整合到宿主的染色体中，因此，可以有多个拷贝数存在在宿主的体内，从而产生高水平表达，但这种表达持续时间很短，常常用来进行启动子等调控序列的分析[34]。早在1987年，Gibson等首先开始了寄生性原虫的电穿孔转基因技术[35]。此后，转基因技术在枯氏锥虫，阿米巴原虫和环状泰勒焦虫体上得到了进一步的发展和应用[36-39]。而转基因技术在顶复门原虫上的应用则开始于1993年首次报道的刚地弓形虫和鸡疟原虫的瞬时转染，自此之后，T. gondii 和 Plasmodium不同物种的稳定转染也成功实现；T. gondii 的转染效率高达50 %，转染技术比较成熟。另外，目前在其它顶复门原虫中，犬新孢子虫（Neospora caninum）、环形泰勒虫（Theileriaannulata）、牛巴贝斯虫（Babesia bovis）和尼氏艾美耳球虫（Eimeria nieschulzi）等也成功实现了瞬时转染。脑住肉孢子虫（Sarcocystis neurona）、柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）等也成功实现了稳定转染，其中 E. tenella 在 1998 年实现了在体外细胞上的瞬时转染，由于球虫在体外细胞上完成其生活史比较困难，而且培养效率较低，使球虫体外稳定转染难以实现。最近索勋等和TomLey等通过在鸡体内扩增实现了E. tenella稳定转染。转染技术在顶复门原虫中取得的突破和进展，使转基因技术成为研究顶复门原虫入侵、代谢等相关基因功能和研制新型疫苗（如活载体疫苗和 DNA 疫苗）、筛选新的药物靶基因和药物敏感性试验等方面有力的分子工具[40-45]，这为转基因技术在隐孢子虫上的应用奠定了良好的基础。
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第 2 章 不同接种途径对贝氏隐孢子虫寄生部位的影响
2.1 材料与方法
接种卵囊为分离自洛阳贝氏隐孢子虫虫株。通过改良抗酸染色法染色，虫体被染成玫瑰红色或深红色，背景颜色为蓝色；以 18SrRNA 基因作为检测基因，利用 PCR 方法进行检测。通过改良抗酸染色法和 PCR 法鉴定最终确定为 C. baileyi。收集到的卵囊保存在 2.5%重铬酸钾溶液中，放置 4℃冰箱中备用。1 日龄雏鸡 120 只（购自洛阳市现代化禽业），饲养在学校动物房内。动物房内汽油喷灯消毒，食槽、水槽经沸水高温消毒，饲养笼子同样经过汽油喷灯消毒，确保在接种前饲养环境中无隐孢子虫存在。雏鸡自由采食和饮水。每天 24h 内均有 200W 灯泡照明，以确保雏鸡正常饲养所需的光照和温度。120 只雏鸡分为 5个组，4 个实验组和 1 个对照组，在接种前，5 个组所喂饲料和水均一样。
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2.2 结果
实验中，从接种后第 4 天开始到第 12 天每天检测 5 组粪便中卵囊数量，结果显示，无论是直肠接种子孢子还是直肠接种卵囊都接种成功，说明通过直肠接种这种试验方法成功。传统方法嗉囊接种卵囊也同样在粪便中检测到大量的卵囊，说明感染成功。但嗉囊接种子孢子和空白对照组的粪便中没有检测到有贝氏隐孢子虫卵囊。具体实验分组方案，每组的接种方式，接种量以及排卵囊时间和高峰期如表 2-1. 观察各组组织切片结果显示，直肠接种子孢子和直肠接种卵囊两个实验组的法氏囊黏膜表面都观察到有大量发育阶段的 C.baileyi 虫体附着在上面，在图2-1A，B 中为两个实验组的法氏囊组织切片，箭头所指均为 C.baileyi 虫体。然而，没有在这两个实验组的其他组织切片图片上观察到虫体。包括盲肠，小肠，前胃，气管以及肺等组织器官。图 2-1C 为气管组织切片图，从图上可以看到气管组织的纤毛层中没有附着虫体。镜下观察雏鸡嗉囊接种卵囊实验组的组织切片时发现，在法氏囊黏膜层，附着有大量内生阶段的贝氏隐孢子虫带虫空泡，但该组的气管黏膜上没有观察到有典型的贝氏隐孢子虫虫体存在。显微镜下观察嗉囊接种子孢子实验组的所有组织切片的结果显示，包括法氏囊，气管，肺等组织器官上均没有发现有虫体附着。
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第 3 章 贝氏隐孢子虫基因调控元件的克隆.........19
3.1 材料与方法 ......... 19
3.2 结果 ..... 26
3.2.1 贝氏隐孢子虫 DNA 提取结果 ........ 26
3.2.2 目的基因的扩增结果 ...... 27
3.2.3 重组质粒的鉴定 ...... 28
3.3 讨论 ..... 30
第 4 章 贝氏隐孢子虫转染载体的构建和瞬时转染.....32
4.1 材料与方法 ......... 32
4.1.1 试验动物 .......... 32
4.1.2 主要仪器设备 .......... 32
4.1.3 主要材料和试剂 ...... 33
4.1.4 试验动物 .......... 33
4.1.5 贝氏隐孢子虫卵囊和子孢子的制备....... 33
4.1.6 贝氏隐孢子虫转染载体的构建....... 33
4.1.7 重组质粒载体 pCbHYH 的转化和鉴定 ......... 35
4.1.8 贝氏隐孢子虫子孢子和卵囊的转染....... 36
4.2 结果 ..... 37
4.2.1 隐孢子虫转染载体的构建 ...... 37
4.2.2 瞬时转染 .......... 38
4.3 讨论 ..... 39
第 5 章 结论....41
第 4 章 贝氏隐孢子虫转染载体的构建和瞬时转染
作为重要的人兽共患病之一的隐孢子虫病（Cryptosporidiosis），其危害严重，不仅影响了家畜的健康生长和养殖业的良好发展，同时威胁着人类的健康。采用新的技术手段来研制出能够防治隐孢子虫病的有效药物和疫苗变得越来越刻不容缓。转染技术在顶复门原虫的应用为研制新的有效的药物，研究隐孢子虫功能基因等提供良好的技术手段。利用转基因技术，可以将新城疫病毒 F 基因、禽流感病毒 HA 基因克隆入表达载体，转染 C. baileyi 卵囊，接种鸡，使鸡产生新城疫、禽流感特异性免疫保护，从而成为理想的真核活疫苗载体。目前，有关贝氏隐孢子虫转染载体构建的报道还很少。同时，相对于其他隐孢子虫来说，贝氏隐孢子虫是感染禽类的优势虫种，其在体外操作简便等使得使用贝氏隐孢子虫来构建真核载体实现瞬时转染的优越性十分显著。因此，在实验中，我们通过构建含有外源黄色荧光蛋白和组蛋白 H4 调控序列的真核表达载体，使用限制性内切酶介导的整合转染方法，将构建成功的表达载体转染至 C.baileyi 卵囊或子孢子中，接种雏鸡后实现体外瞬时转染，为研制隐孢子虫病药物提供良好的基础和技术手段。
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结论
1. 首次由直肠接种 C. baileyi 子孢子和卵囊，并成功感染鸡的研究。C. baileyi的寄生部位依赖于不同的接种途径，而且 C. baileyi 不通过血液进行传播。
2. 成功构建表达黄色荧光蛋白 pCbHYH 的转染载体，并成功实现贝氏隐孢子虫瞬时转染，为隐孢子虫稳定转染及其基因功能研究提供有效的分子工具。
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参考文献（略）