前言
目前，直结肠癌的发病率在全球逐年上升，对于其发病机制，多数研究均认同直结肠癌的发生和发展是一个多基因在多阶段发生改变的过程，其每个过程都会出现癌基因的激活或者是抑癌基因的失活。直结肠癌的行程过程比较缓慢，大多是由粘膜病变逐渐发展成为腺瘤状息肉，最终演变成具有侵袭性和转移性的癌。尽管人们对于直结肠癌的发生，发展以及治疗有了较多的认识，但是对于直结肠癌的早期诊断仍然缺乏特异性的指标，发现时多数已属中晚期，侵袭和转移仍然是直结肠癌的主要死因。由于早期直结肠癌无转移，通过手术切除往往可以获得良好的治疗效果，因此直结肠癌的早期发现，寻找研宄与直结肠癌发生发展的密切相关的新型肿瘤标志物尤为重要。蛋白质组学和基因组学的发展，增进了人们对疾病的了解。这些领域揭示了各种疾病过程中蛋白质序列的显著性差异。测量在某些疾病中特定表达的蛋白质可以作为诊断或预后评价的指标。Glowacki等[14人为其白蛋白构象变化可能是由于肿瘤细胞产生的酶和其他配体对白蛋白的修饰导致其构象的改变。例如，高半胱氨酸(Hey)硫内酯修饰的白蛋白形成了 N-Hcy白蛋白，限制了蛋白质结构的改变。然而，通过测量与蛋白质相关的配体对蛋白质结构和功能的改变也是一种有效的方法。血清白蛋白在调节肿瘤细胞产生的各种蛋白的浓度中起着重要的作用。电子自旋共振中常用的自旋标记技术，它能够评估白蛋白与其他配体结合后结构和功能的改变。血清白蛋白在调节肿瘤细胞所产生的各种蛋白质以及配体的浓度中起着重要的作用。既然这些肿瘤衍生的蛋白质本身可以确定是否有肿瘤存在，那么检测白蛋白与肿瘤衍生蛋白结合后，其结构和功能的改变，可能是另一种判断肿瘤存在与否的方法。用电子顺磁共振（EPR)的波谱仪观察自旋标记的白蛋白的信号，是一种用于评估蛋白和配体结合后结构和功能改变的有效工具。这些蛋白质结构和功能的改变，通过蛋白结合的自旋标记物分子流动性和亲和性这些性质，可以较容易地判断出来。16 DOXYL硬脂酸中的氧自由基可应用于白蛋EPR波谱信号的自旋标记。自旋标记物通过与蛋白质的不同区域结合，得到的EPR波谱可以提供a-螺旋和折叠的构象组成，以及各个结构域彼此的相对位置的信息和蛋白质整体结构的变化。
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1.2自旋标记
早期电子顺磁共振技术要求被检测的对象是具有成对电子的物质，即所谓的“顺磁性物质”，例如自由基或者顺磁性过渡金属离子等。但是在自然界特别是在生物界，多数物质并不是顺磁性的或者其中顺磁性成分的含量非常低，现有的电子顺磁共振一起无法检测出来。限制了 EPR技术的应用范围。1965年美国化学家HMMcConnell等提出对被研宄的样品施行自旋标记，从而实现了非顺磁性物质的电子顺磁共振研宄，这样的方法被称为自旋标记电子顺磁共振。由于它对被研究的对象不需要特别的分离处理，也不会破坏和损伤被研宄的生物材料，所以大大的扩展了电子顺磁共振技术在生物医学中的应用自旋标记，是将某些稳定的自由基（或者顺磁性的报告基团）按照共价键或者非共价键的方式加到被研究的体系的特定部位上，然后借助于这些自由基（或报告基因）的EPR波谱来分析该体系的微观结构、运动状态和理化特性，例如分子所处环境的极性、微黏度的变化、分子的运动速率和空间构象以及分子之间的相互作用等各种信息。这些稳定的自由基（报告基因）就是自旋标记物(spinlabd)。早期人们还把按照非共价键方式结合的自旋标记物称为自旋探针(spin probe)。
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第二章材料和方法
2.1本文涉及的实验材料
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2.2仪器设备
2.2.1仪器的标定
本实验采用德国Bruker公司生产的X-band (l00kHz) A300型EPR谱仪进行测量。谐振腔的型号为ER 4119HS-LC，它的调制幅度可以达到20G，具有较高的灵敏度，空腔状态下品质因子Q值是6000。每次进行样品电子顺磁共振测量之前，都要对仪器进行稳定性的测量，釆用配备的电子顺磁共振校准样品中ER-213-SPS的固体强度校准样品，确保分析检测结果的可靠性，准确量值的标准样品是公正、科学和权威的依据，如果有异常需要对仪器进行手动调试。
2.2.2仪器的使用以及注意事项
1.整套设备开机先后顺序
(1)打开总电源。
(2)开启水冷机。
(3)开启主机。
(4)开启磁场和微波桥。
(5)谐振腔调谐。
2.仪器使用过程中的注意事项
(1)打开电脑，双击“WinEPR Acquisition”打开釆集控制软件。如果微波桥控制窗口没有打开，点击工具栏中“MW”按钮开启。
(2)插入样品管，使样品中间位置对准腔中间位置。在将样品插入谐振腔之前一定注意要用纸将样品管擦拭干净，以免谐振腔污染。在插入样品管的同时注意防止样品管碎裂。调整样品位置和腔长时，不要用力过大、过猛，以免损坏样品管和谐振腔。
(3)装样时，极性溶剂用毛细管虹吸，下端用橡皮泥封口，注意留一段空气以免干扰测试。
(4)将操作模式设为“Tune”状态进行粗调，设“attenuation (衰减)”为30dB，调节“Frequency (频率)”，使Dip (黄色曲线，微波源频率）位于中心位置，以绿线（腔的共振频率）为基准对称；调节“SignalPhase(相位)”使模两边基线平齐；如果Dip深度太浅，调节“Ms”使其增加。
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第三章实验结果......... 16
3.1直结肠癌病人、健康人血清白蛋白EPR波谱........16
3.2线性判别模型的建立........ 17
3.3判别函数的建立........ 18
3.4健康人与直结肠癌病人的判别结果........ 18
第四章讨论........ 19
4.1自旋标记物的选择 ........19
4.2样品的保存以及制备........ 20
4.3波谱仪测量参数的选择 ........21
4.4波谱的分析 ........21
4.5实验数据处理及误差分析........ 22
4.6研究工作的改进........ 22
第五章结论........23
第四章讨论
直结肠癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在不同的区域差异很大，以北美和大洋洲最高，欧洲居中。在我国，东南沿海的发病率明显高于北方地区。近10年来，直结肠癌的发病率呈现明显的上升趋势，我国直结肠癌的发病率上升趋势更是尤为明显[16]。白蛋白是非致病性血装中最丰富的蛋白质，约占血楽总蛋白的三分之二。临床上肝功能检测白蛋白的意义是根据白蛋白检测结果可对某些疾病进行判断一般情况下，白蛋白增高主要见于血液浓缩而致相对性增高，如严重脱水和休克、严重烧伤、急性出血、慢性肾上腺皮质功能减低症[19-29]。白蛋白降低常见于肝硬化合并腹水及其他肝功能严重损害(如急性肝坏死、中毒性肝炎等)营养不良、慢性消耗性疾病、糖尿病、严重出血肾病综合征等。血菜白蛋白的一个重要特性是具有结合其他物质的能力，如结合正常的代谢产物：长链的脂肪酸、类固醇、胆红素和很多外来的非生物物质如药物和染料等，还能非专一地结合几种激素[21-22]。随着分子生物学的发展，血清或许可以作为肿瘤标志物成为恶性肿瘤篩查的有效手段。但是临床上常用的肿瘤标志物的敏感性和特异性比较低，因此需找新的肿瘤标志物成为了临床研究的热点问题[23-25]。国外已经有学者研宄表明，对于无症状的人群进行直结肠癌的蹄查可以尽早发现癌症，从而能够有效的降低直结肠癌的死亡率，因此很多国家都开展了直结肠癌的蹄查工作[22]。亚洲国家中只有新加坡、韩国、日本以及中国台湾制定了相应的蹄查指南。近些年来随着生活条件的改善，越来越多的单位和个人进行年度常规体检，但是普通的查体仅仅包括一些常规的项目，如三大常规、肝功能、腹部超声、胸片等，很少关于肿瘤的蹄查。只有少部分经济条件好、健康意识强的体检者会主动差一些肿瘤相关的标志物。
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结论
直结肠癌病人、健康人血清白蛋白与自旋探针结合能力不同，肿瘤相关的血清白蛋白的变化可以通过自旋标记的电子顺磁共振波谱来评价，自旋探针标记的血清白蛋白电子顺磁共振波谱诊断直结肠癌具有较高的诊断特异性和敏感性，该方法有可能成为临床新的直结肠癌实验室诊断方法。
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参考文献（略）