第一章文献综述
1.1 A型流感病毒的进化
在流感病毒大家族中，A型流感病毒的宿主分布最为广泛，可感染禽、人、猪、马、狗、猫、海洋哺乳动物（海豹和嫁）等[5-8]。在整个A型流感病毒的生态分布中，野生水禽是主要的自然lit存宿主和基因库，目前发现的几乎所有A型流感病毒亚型（包括16个HA亚型和9个NA亚型）都存在于野生水禽中[5，9]。尽管这些A型流感病毒已经存在了几个世纪，并且一些亚型的病毒对它们的天然宿主是非致病性或无毒力的，但是也有许多亚型对它们的天然宿主或其它宿主具有高毒力[10]?尤其是一些亚型的流感病毒极易发生跨宿主感染，例如，高致病性禽流感(HPAIV) H5N1病毒在野禽和家禽中的角色转变已经被证明是对人类公共卫生的潜在威胁，因为它经过在家禽中适应后理论上具备了在人类传播的能力。A型流感病毒的生态学是动态的且复杂的，涉及到多个宿主和病毒基因。商业化家禽养殖场、活禽市场、散养型养殖场、商业或家用屠宰设施、猪场、人类饮食习惯、外来物种的全球交易等对流感病毒的传播都有影响。东南亚活禽市场上的人、猪、鸭、踏、鸡以及其它动物都对人类的公共卫生健康构成了严重的威胁[12，13]。AIV侵入人体后必须能够有效地复制才能突破其宿主范围限制性。一般情况下，AIV不能在人体细胞内进行有效复制，这主要是与病毒的RNA聚合酶（PB2、PBK PA)有关。RNA聚合酶进入感染动物细胞核后具备高水平的基因组转录和复制能力是病毒跨越宿主范围的一个重要决定因素。其中，PB2蛋白上第627位氨基酸残基在病毒致病力和跨宿主感染方面起到重要的决定作用[18，19]；而PB2上D70IN和NP上N319K的突变能加强该两种蛋白与哺乳动物细胞内核转运蛋白的相互作用，从而提高蛋白转运到细胞核的效率[20]。此外，越来越多的研究表明聚合酶的各个成分对流感病毒的宿主范围限制性均有重要的决定作用。
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1.2猪是流感病毒的混合器
猪对禽流感和人流感病毋均易感，当这两种病違共感染一头猪的时候基因重排就很可能发生[35]。二源（禽/人；人/猪）和二源（禽/人/猪）重排病毒己经在美国成中国的猪群中分离到，这为猪的‘‘混合器”理论提供了有力的证据。早在1919年，JCoen指出流感爆发是从人成者猪里开始出现的，然后―者相互之间快速转移。Greger，对禽流感进行了全面的论述并提到流感病森人和猪之间可以很容易地相互传染[11]。如前面所述，1957年亚洲和1968年香港流感人流行是人源和禽源流感病毒重排产生的[28，36]。然而，到0前没人知道这些病毒是如何产生的。主耍有两个巫排假说：1)首先禽流感病逛传播至人类，然后人流感病遥重排；2)禽和人流感病3}共同感染同一个未知的棺主并发生重排（如猪），然后这个重排病毒传播至人类[37]。在猪体内易丁?产生新別重排病毒的审实导致了 “泥合器”理论的出现（阁1-3)。这个理论宵先由Scholtissek^人提出（1985)，主耍是基丁?人流感病毒不易丁?感染禽（反之亦然），而与猪之间的种间障碍门滥较低[35，38]。禽、猪、人流感病岛之间的抗原和遗传相似性，以及猪对禽流感和人流感病毐的易感性形成为了理论基础。人多数禽流感病毒和人流感病毒分别结合SAa2.3 Gal(禽受体）和SAa2,6 Gal (哺乳动物受体）述接的糖类受体[39，40]。这两种受体在猪呼吸道上皮细胞上均有分布。这为猪作为禽、人流感病為“泥合器”的理论提供了基础。
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第二章H1N1/2009 “前体”病毒在猪体中传代
2.1材料
2.1.1病毒
rHlNl病毒由本实验室通过反向遗传构建：PB2、PB1、PA、NP、HA、NS基因来自A/Swine/Guangdong/1222/2006 (H1N2)病毒，该病毒由本实验室分离于广东一发病猪场，经进化树分析该病毒为北美三源重排猪流感H1N2病毒；NA和M基因来自A/Swine/Fujian/204/2007 (HIND病毒，该病毒由本实验室分离于福建一健康猪场，经进化树分析该病毒为欧洲类禽猪流感病毒。rHlNl病毒的基因片段均与H1N1/2009病毒的在同一大进化分支。大流行H1N1病毒株A/Swine/Shandong/731/2009于2009年12月从山东猪群中分离到，GenBank中全基困组序列的序列号为 FJ951848-FJ951855。
2.1.2购买材料及试剂
DMEM细胞培养液、澳洲胎牛血清、PBS缓冲液由Invitrogen公司生产。舒泰由Virbrac公司生产。一次性粘膜雾化装置购自Wolfe Tory MedicaUnc.公司。EDTA-胰蛋白酶由迈晨科技有限公司生产。TPCK-胰蛋白酶由Sigma公司生产。流感病毒NP蛋白单抗购自Abeam公司。FITC标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德公司。96孔细胞培养板、1.5ni丨灭菌离心管、lOml无菌移液管、2ml/5in丨灭菌离心管购自美国康宁公司。10ml —次性注射器、尼龙绳、乙醇棉、解剖器械、静脉滴注用的导流管、平皿、烧杯等器械或试剂购自北京泽平有限公司。
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2.2方法
(1)试验设备仔猪置于生物安全级别（BSL) 2+的全封闭负压动物房，不同组置于不同隔离间，进入时换好隔离服和防毒口罩，防止病毒带入或带出。
(2)仔猪攻毒前的词养筛选好的仔猪首先在隔离间适应两天，然后用于攻毒试验，期间每天定时词喂（每天两次），观察记录正常仔猪的状况，以便为攻毒后临床症状的观察作参考。
在感染前需对rHlNl病毒进行TCID5G定量（见2.2.2),定量后用灭菌PBS稀释至TCIDso/ml
(4)病毒接种用装有rHlNl病毒液的一次性粘膜雾化装置，对第一代仔猪（1头）进行鼻腔喷雾接种待测病毒[93]。
(5)临床症状观察于攻毒后第1天（1dpi)幵始，每天两次定时测量攻毒猪的直肠温度（>39.5°C为发热)，并仔细观察记录临床症状（观察20-30miii)，主要症状包括食欲下降（厌食）、精神不振、扎堆、颤栗、眼分泌物、鼻涕、喷噴、咳嗽、拉稀等。记录每项症状出现的具体情况以及严重程度。
(6)样本采集在攻毒后1-4天，每天釆集鼻拭子，将拭子放入离心管中-8(rC保存。在4dpi对猪实施安乐死，然后对猪进行剖检，采集所需要的样本。鼻洗液：将猪解剖，取下气管和肺后，用装有导流管的10ml注射器吸取lOml双抗PBS，将导流管从喉头处插入鼻腔，用力将PBS推入鼻腔，让洗液流入接好的平皿中，反复冲洗5次，最终将剩余的大约5ml鼻洗液收集入离心管中。
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第三章第九代病毒样本的遗传变异分析.....34
3.1材料..... 35
3.2方法..... 35
3.3结果..... 40
3.4讨论..... 45
3.5小结..... 46
第四章第九代病毒克隆株的体外活性测定..... 47
4.1材料..... 48
4.2方法.....50
4.3结果.....55
4.4讨论..... 60
4.5小结..... 61
第五章第九代病毒克隆株对猪的致病性..... 62
5.1 材料..... 62
5.2 方法..... 63
5.3 结果..... 64
5.4讨论.....70
5.5小结.....71
第七章第九代病毒克隆株对雪紹的致病性及其呼吸道飞沬传播性
7.1购买材料及试剂
DMEM细胞培养液、澳洲胎牛血清、PBS缓冲液由Invitrogen公司生产。舒泰由Virbrac公司生产。一次性粘膜雾化装置购自WolfeToiyMedical，Inc.公司。EDTA-胰蛋白酶由迈晨科技有限公司生产。TPCK-胰蛋白酶由Sigma公司生产。流感病毒NP蛋白单抗购自Abeam公司。FITC标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德公司。96孔细胞培养板、l.;5ml灭菌离心管、10ml无菌移液管、2ml/5ml灭菌离心管购自美国康宁公司。ImlAOml一次性注射器、乙醇棉、解剖器械、平皿、烧杯等器械或试剂购自北京泽平有限公司。
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结论
1、本研究发现与H1N1/2009病毒基因组合方式一致的rHlNl病毒经过九代猪体传代之后具备了增强的复制力、致病性和传播性，包括增强的体外复制力和聚合酶活性，在猪、藤鼠、雪紹体内增强的复制力，对猪和雪紹增强的致病性，在猪和膝鼠中增强的接触传播力。重要的是，来自肺中的第九代病毒克隆还具备了雪紹间的呼吸道飞沫传播能力。
2、第九代病毒克隆致病力和接触传播力的增强是由PB1 A469T、PA 1129T、NA N329D、,NS1 N205K 和 NEP T48N 五个突变造成的，其中 PB1 A469T 和 NS1 N205K&NEP T48N 突变对接触传播力的产生具有决定性作用。更重要的是，HA蛋白上的D187E、K211E和S289N还能够进一步赋予rHlNl病毒雪紹间呼吸道飞沫传播能力。
3、本研究发现流感病毒在猪体传代后能够产生增强的致病力和传播性，并且这些在猪体内自然产生的病毒具有与大流行病毒类似的特性，表明单纯的猪宿主就有能力通过诱导流感病毒发生适应性变异使其具备大流行潜力。
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参考文献（略）