第一章引言
1.1国内外研究现状
EMCV病毒粒子呈圆形，直径约27nm，无囊膜。基因组为单股正链RNA,全长约7 800 bp,分别由5’端非编码区（5’ untranslated region, 5’ UTR)、一个编码多聚蛋白的开放阅读框（ORF)和 3’ 端非编码区（3’ untranslated region, 3’ UTR)组成。5’ UTR 包含 Ploy (C), VPg 以及内部核糖体进入位点（IRES)。3’ UTR含有病毒RNA合成所需的顺式作用元件、终止密码子以及Poly(A)。ORF编码的多聚蛋白在病毒自身编码的特定蛋白酶（2A蛋白酶、3C蛋白酶及从P3前体蛋白切割下来的蛋白酶）作用下裂解成先导蛋白（L)和P1、P2、P3三个中间体，这三个中间体进一步裂解产生U个成熟的病毒蛋白，即4个结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4)和7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C 和 3D)。四个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成病毒衣壳，其中VP1、VP2和VP3位于病毒粒子的表面，VP4位于衣壳内侧并紧贴VP1-VP2-VP3复合体这四个蛋白均参与病毒抗原位点的形成。病毒非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)主要是编码病毒基因组复制相关蛋白和蛋白加工相关蛋白。2A和3C编码为蛋白酶，参与多聚蛋白加工和剪切，2B和2C主要负责细胞膜的渗透性和细胞内膜的重排，3A是一个膜结合蛋白，它在抑制细胞蛋白的分泌和介导膜蛋白的运输方面起着重要作用，而3B是病毒编码的最小蛋白，它共价结合到病毒基因组的5’端，协同3D (RNA依赖的RNA聚合酶）参与病毒RNA的复制。
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1.2研究目的和意义
本实验室前期研究证实，EMCV感染能够诱导宿主细胞发生自唆，并且细胞自啦利于病毒的复制。然而，哪些病毒蛋白参与了 EMCV诱导的自暖过程，EMCV复制的增加与其诱导的细胞凋亡间又存在何种关系却不得而知。本研究旨在分析参与EMCV诱导细胞自嗟和调亡的病毒蛋白及其分子机制，以期为深入研究EMCV与宿主细胞相互作用的分子机制和EMCV的分子致病机理提供科学依据。有研究显示丙肝病毒在感染过程中诱导细胞自嗟就是通过激活ER stress和的通路来完成的然而，当ER stress持续发生时，UPR的活化不足以消除这种应激反应,就会导致ER stress依赖的细胞凋亡产生。对EMCV而言，ER stress是否参与了病毒诱导细胞自嗟的过程？ EMCV通过何种机制来诱导细胞凋亡发生？到目前为止，这些科学问题尚未阐明。综上所述，EMCV对养猪业的明显影响及其所具有的公共卫生学意义，使其受到高度关注，从EMCV(或某些病毒蛋白）与宿主细胞蛋白间相互作用着眼进行深入研究,不但对于阐明EMCV与宿主细胞相互作用的分子机制具有重要的科学意义，也可为揭示该病毒的致病机理提供科学依据。
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第二章脑心肌炎病毒诱导细胞自睡病毒蛋白的鉴定及其分子机制
2.1前言
内质网是哺乳动物细胞中一个重要的合成场所，它严格控制膜蛋白和分泌蛋白的数量，而且也是一个参与信号起始和转导的部位，可应对各种应激反应，包括病毒感染I58’ 为了减轻或消除这种应激反应，宿主细胞通过激活UPR通路上调内质网伴侶分子和其它基因的转录，也可暂时抑制蛋白质的合成，最终诱导细胞哩的发生。研究报道显示，—些病毒蛋白可激活ER stress和UPR通路。例如：丙肝病毒的非结构蛋白NS4B能通过激活ATF6a和IRE-XBP1通路;西尼罗河病毒的NS4A也能活化UPR通路本实验室前期研究表明，EMCV感染诱导细胞自嗟的发生，并且自哩的诱导利于病毒自身的复制那么，EMCV中哪些病毒蛋白参与病毒诱导的细胞自唆过程？它们诱导的机制是否也是通过激活ER stress和UPR通路来实现的？本章我们将分析EMCV各病毒蛋白诱导的细胞自嗟，并进一步分析其分子机制。
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2.2材料与方法
2.2.1材料
2.2.1.1细胞、病毒和质粒
幼龄仓鼠肾细胞（BHK-21)，由中国农业大学农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室保存。用10%胎牛血清（FBS)的DMEM培养基，在37 °C下5 %C02的细胞培养箱中培养。EMCV BJC3,由中国农业大学农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室保存将EMCV BJC3接种BHk-21细胞，于37 °C 5% CO2的细胞培养箱中感作1 h后，换成2% DMEM培养液于培养箱中继续培养约20 h，待细胞完全崩解后将其于-20 °C冰箱中反复冻融2次，4 X：下10000 r/min离心15 min，收集上清作为病毒原液，毒价约为4.7xl09PFU/ml质粒 pEGFP-Cl 和 pCMV-HA 购自 Clontech 公司；pGL3-Basic 和 pRL-TK 购自 Promega 公司。
2.2.1.2主要试剂
衣霉素（Tunicamycin, Tu;)和毒胡萝卜素（Thapsigar^in, Tg;)购自Sigma公司。细胞核染料(4’，6-Diamino-2-phenylindole, DAPI；)和 RIPA 裂解液购自碧云天公司。转染试剂 LipofectamineLTX&PLUS 和 RNAiMAX reagent 为 Invitrogen 公司产品。
2.2.1.3 抗体
多克隆抗 Grp78 (3183)、Grp94 (2104)、PERK (3192)、phospho-PERK (3179)、eIF2a (9722)和 phospho-eIF2a (3597)抗体购自 CST 公司。抗 LC3 (L7543)、p62 (P0067)、HA (H3663)和p-actin (A1978)抗体，FITC标记山羊抗鼠IgG和辣根过氧化物标记的山羊抗鼠或兔IgG均为Sigma公司产品。多克隆抗ATF6(X和Beclinl抗体购自Santa公司。EMCVVP1蛋白的单克隆抗体由中国农业大学农业部动物流行病学与人畜共患病重点实验室制备。
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第三章脑心肌炎病毒2C与Beclinl相互作用分析.......... 28
3.1前言 ..........28
3.2材料与方法.......... 28
3.3结果与分析.......... 36
3.4讨论 ..........46
3.5小结 ..........48
第四章结论.......... 49
第五章创新点 ..........50
第三章脑心肌炎病毒2C与Beclinl相互作用分析
3.1前言
2C蛋白是所有微RNA病毒科病毒中最保守的病毒蛋白，同时2C样蛋白在其它动物或植物病毒中也有发现。EMCV的2C蛋白编码325个氨基酸，其分子量为37.5 kDa，是病毒RNA复制复合体中的成员。2C蛋白具有多种生物学功能，包括参与RNA的复制膜的结合NTP的结合ATP酶与GTP酶的活性和装配成熟病毒粒子虽然EMCV 2C蛋白的功能已被广泛研究，但为了更有效地控制EMCV感染，进一步去探究EMCV感染过程中病毒与宿主间的关系和鉴定与2C蛋白相互作用的细胞组分是非常必要的。Beclinl是第一个确认的哺乳动物自喷基因，它是酵母自麼基因Atg6/Vps30的同源基因Beclinl分子中含有三个不同的功能区，包括BH3、CCD和ECD，它们可作为一个互作平台来招募和调控自嘴相关的调节分子，通过促进复合体的聚集而形成自啦泡大量研究表明，很多病毒可通过调控自唆通路相关分子Beclinl而利于自身病毒的复制和逃避宿主的免疫防御。此外，也有研究发现，BecHnl在细胞阔亡的方面也具有重要作用，而且由活化的caspase介导Beclinl的裂解能提高细胞调亡水平。最近研究显示，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染过程中，Beclinl可与2C相互作用调控自嚼过程，从而利于病毒复制因此，EMCV感染BHK-21细胞的过程中2C是否与Beclinl相互作用值得研究。本章将分析EMCV感染细胞过程中2C与Beclinl的相互作用以及在调控细胞调亡和病毒复制中的分子机制，以期深入了解EMCV与宿主细胞间相互作用关系的生物学意义。
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结论
4.1利用透射电镜、Western blotting和激光共聚焦免疫焚光等技术分析了脑心肌炎病毒（EMCV)各病毒蛋白诱导细胞自嚼的能力，结果表明，非结构蛋白2C和3D参与病毒诱导的细胞自趣过程，并引起内质网应激和UPR通路活化。
4.2利用免疫共沉淀和激光共聚焦免疫突光等技术证实EMCV的2C考白与宿主细胞蛋白Beelinl存在相互作用，其作用机制是在病毒感染后期2C蛋白介导Beclinl发生裂解而促进Bax转移到线粒体中，增加细胞调亡水平，从而有利于病毒复制。
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参考文献（略）