1.引言
1.1志贺氏菌概述
在人类胃肠道中存在着不同种类的微生物，益于人类的健康致病微生物入侵胃肠道时，需要冲破这些天然屏障。机体本身也阻止病原微生物的入侵，包括胃酸环境、肠道上皮粘液、抗菌肽、上皮细胞快速更新、机体中的嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞等尽管如此，一些病原微生物通过进化获得了入侵人类胃肠道细胞的能力，志贺氏菌就是其中一个成功的例子。作为革兰氏阴性菌的志贺氏菌寄生在宿主细胞内，无鞭毛，不能形成芽孢和荚膜。通过人与人或污染的水和食物进行传播，仅需10 -100个细菌就可以引起感染[5]。机体一旦摄入志贺氏菌，该菌通过胃肠道，定殖于大肠的结肠处，释放毒力因子导致机体致病。轻微引起痢疾（细菌性），感染严重时，会引起人类患上溶血性尿毒综合症和菌血症等，危及生命世界卫生组织估计，每年因感染志贺氏菌死亡的人数在100多万。自从Kiyoshi Shiga 1887年第一次观察到志贺氏菌以来，人们对志贺氏菌的认识越来越多。目前，国际微生物学会认为目前存在4类志贺氏菌：痴疾志贺氏菌，福氏志贺氏菌，鲍氏志贺氏菌和宋内志贺氏菌。鲍氏志贺氏菌主要分布在印度痢疾志贺氏菌具有致死性；福氏志贺氏菌普遍流行；宋内志贺氏菌常伴随其他疾病一起感染。流行病调查，福氏志贺氏菌在发展中国家每年的感染占60%，而在我国高达70%。
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1.2志贺氏菌感染途径
志贺氏菌感染机体细胞是一个复杂的过程，关于其致病机制目前还没有完全阐述清楚。普遍认为，志贺氏菌一般是经口进入胃肠道中，到达大肠的结肠和直肠部位进行感染。由于肠道上皮细胞紧紧挨在一起，分泌粘液等特点，志贺氏菌最先入侵的是肠微糟皱细胞（tnicrofold cells, M细胞）。位于肠道點膜上皮细胞内的M细胞主要功能是将免疫原从肠腔运输到上皮细胞下面的淋巴组织，进而引起一系列的抗原-抗体反应。细菌进入M细胞后，被其下方的巨唾细胞所吞唾。吞唾1-2小时后，志贺氏菌可以诱导巨唾细胞死亡。细菌通过两个途径导致巨噬细胞死亡：一个途径是效应蛋白IpaB激活caspase-1释放IL-1 P”.；另一个途径是通过lipidA的易位，该途径不依赖caspase-1和Toll样受体[⑴。志贺氏菌杀死巨唾细胞后并从其中逃离出来，进入上层细胞的基底部。此时的志贺氏菌通过毒力大质粒编码的T3SS与上皮细胞膜接触进入细胞。在志贺氏菌诱导巨唆细胞死亡的同时释放大量的IL-ie和IL-18。IL-18增强NK细胞表达Fas配体，促进Thl细胞产生IFN-丫等细胞因子作为内皮细胞活化因子IL-IP ,是一种激素样肽类物质，主要起免疫调节作用。与此同时，IL-10可以招募嗜中性粒细胞，其迁移破坏了上皮细胞的紧密连接，更有利于志贺氏菌侵入肠细胞。
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第一部分M90T-290组成成分的研究
1. 实验1利用BN-PAGE分离志贺氏菌5a M90T缺失突金株膜蛋白复..合物
前期的实验通过蓝色非变性聚丙炼酷胺凝胶电泳（Blue NativePAGE. BN-PAGE)比较志贺氏菌两种状态下膜蛋白复合物谱，发现福氏志贺氏菌(Shigella flexneri) 5a M90T野生株存在特有的复合物M90T-290，然后通过SDS-PAGE分离及质谱结果证明该复合物由毒力大质粒编码 Apyrase 和染色体编码 D.naK、ClpB、YdgA、 EF-TU.、GapA组成…、那么质谱鉴定到的各蛋白是否是M90T-290的组成成分？各蛋白在体外相互作用关系是如何？
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2.2 M90T膜蛋白复合物的制备
挑取新鲜的福氏志贺氏菌M90T野生株、M90TApWR100、M90TAphoN2、M90T A dnaK、M90T A ydgA 和 M90T A clpB 单菌落于 5mLTSB 培养基中，在371摇床中进行振荡培养4h，然后将振荡培养的菌液全部转至新鲜的200mLTSB培养基中，以同样条件进行培养6h后，收集培养的菌液，取出一定量的菌液进行测量0De。及活菌计数。低温，低速离心菌液，收集菌体沉淀，用新鲜配制的20%鹿糖溶液重悬沉淀，低温，低速离心收集沉淀部分，用5mL新鲜配制的20%蔗糖溶液重新将沉淀悬浮，然后依次加入0. 5inLlMTris-HCl (pH8. 0). 20u L 0. 5M EDTA(pH8. 0)，蛋白酶抑制剂 1/2 片，溶菌酶40mg，37°C进行2h的温育获得原生质体。4°C、l0000r/min离心20min。获得的原生质体用ImL新鲜配制的20%蔗糖溶液重悬，然后快速加.入去离子水47. 5mL，轻轻摇晃，再加入1M MgCla 0: 5mL，蛋白酶抑制剂1/4片，l0ku DNasel 10 U L，置于冰上作用30rain进行消化核酸。在润旋仪上充分混匆配制的.各浓度胶，采用从上往下方法进行灌胶：在梯度混合仪中分别加入15%和10%的胶溶液（梯度混合仪前后），通过續动菜将胶溶液灌入玻璃板中，灌胶完成后用饱和的正丁醇进行封胶。待下层凝胶聚合后用纯水清洗干净后，再灌入3. 5%的压缩胶，插上上样梳。提取的样品与BN Loading Buffer按1:1的比例混合，上样。存上槽中加入蓝色阴极电泳缓冲液（15mM Bis-tris、50mM tricine、0. 02%考马斯亮蓝G250)，在下槽中加入无色阳极缓冲液（SOmMBis-tris)。进行电泳，先恒压50V电泳30min、100V电泳50min，然后将阴极的电泳缓冲液弃掉，加入无色的阴极电泳缓冲液，200V电泳过夜。跑胶结束后，胶在固定液（SOOmL甲醇、23. 5mL憐酸加水至lOOOmL)固定Ih后，纯水轻轻冲洗后，加入考马斯亮蓝染色液染色。
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3 实验二 M90T-290各亚基相互作用分析........ 18
3.1实验材料 ........ 18
3. 1. 1菌株与质粒........ 18
3. 1. 2主要仪器 ........ 18
3. 1. 3主要试剂和抗体........ 19
3. 2实验方法 ........20
3. 3实验结果 ........26
3. 4 讨论 ........ 39
第二部分 M90T-290与志贺氏菌M90T株毒力相关研究........ 40
4 实验三志贺氏菌M90T感染HeLa细胞体外模型........40
4. 1实验材料........ 40
4.2实验方法 ........ 40
4. 3实验结果 ........ 41
4. 4 讨论 ........ 42
5 实验四M90T-290功能验证........ 40
5. 1实验材料........ 43
5.2主要试剂和实验仪器........ 43
5. 3实验方法 ........ 43
5. 4 结果........45
第四部分M90T-290具体来源的研究
BN-PAGE观察野生株膜蛋白复合物（图28)，发现在M90T-290下面存在着一条条带，通过高分子量蛋白标志物比较，分子量约为260kDa,命名为M90T-260( A pWRlOO也存在这条条带，命名为AM90-T260) 0为了鉴定膜蛋白复合物M90T-260 ( A M90-T260)的具体组成，将它们还原处理后，进行二向SDS-PAGE及MALDI-TOF-TOF,如图（29) M90T-260 ( A M90T-260)是由染色体编码的四个蛋白（DnaK、YdgA、EF-TU、GapA)(图30)构成的亚复合物，而M90T-290则是由毒力蛋白Apyrase (图30)与染色体编码的四个蛋白共同形成。
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结论
本研究在前期BN/SDS-PAGE发现志贺氏菌M90T所特有的膜蛋白复合物M90T-290的基础上，研究了 M90T-290结构及在志贺氏菌中致病过程中的致病机理，得到以下结论：
1.志贺氏菌(Shigella flexneri) 5a M90T所特有的膜蛋白复合物M90T-290 是由 Apyrase、DnaK、YdgA、EF-TU 和 GapA 组成，且 M90T-290各亚基间存在广泛的两两相互作用。
2.通过细胞水平和动物水平验证，M90T_290是毒力相关复合物。
3.初步探讨了 M90T-290的毒力机制：与毒力蛋白VirG协同影响宿主细胞actin的聚集，促进志贺氏菌在胞间和胞内扩散。
4.进一步考察志贺氏菌膜蛋白复合物谱，发现M90T-290是Apyrase结合了染色体编码的亚复合物形成。本研究发现了志贺氏菌毒力相关的膜蛋白复合物，命名为M90T-290,该复合物是由毒力大质粒编码的Apyrase结合了染色体编码的亚复合物M90T_260(组成成分包括DnaJC、YdgA、EF-TU及GapA)形成。它的致病机制是与毒力蛋白VirG协同影响宿主细胞actin的聚集，促进志贺氏菌在胞间和胞内r散。本研宄不仅为志贺氏菌毒力大质粒和染色体间协同进化提供了新的证据，为研究志贺氏菌的致病机制提供新的线索，而且有可能为坑细菌感染提供了潜在的药物勒目标。
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参考文献（略）