前 言
“旁效应”这个术语曾广泛用于基因治疗领域，它是指受基因转导的细胞可以杀死其周边细胞的现象。但这个现象并非基因治疗所独有，类似的现象也在电离辐射领域存在，被称为电离辐射诱导旁效应，它是指受照射细胞引起其周围未受照射细胞发生一系列的生物学改变。关于辐射引起旁效应现象的报道最早出现在1922 年，MurphyJB 等人（1）发现未受照射动物的血清会引起体外淋巴细胞的快速分解，但受照射动物的血清却能刺激淋巴细胞的生长。在 20 世纪五、六十年代，又有几个报道显示旁效应的存在，其中包括：用低 LET（linear energy transfer）辐射照射儿童病人的脾脏来治疗慢性粒细胞白血病后，发现病人的胸骨骨髓出现了损伤（2）；用受低剂量照射的大鼠或绵羊的血浆或血液超滤液处理未受照射大鼠，可以诱发大鼠乳腺肿瘤（3）；用受照射病人的血浆短暂培养淋巴细胞后，就可导致淋巴细胞的染色体损伤（4）。但是即使有这些关于辐射诱导旁效应现象的报道，该现象也未能引起研究人员的重视。一直到 1992 年 Nagasawa 和 Little 等人（5）发现在一个细胞群中，当只有 1%的细胞受到低剂量α粒子照射时，却有 30%的细胞发生姊妹染色单体互换增加，显示低剂量的α粒子辐射在没有受到粒子穿过的细胞中诱导了遗传物质的损害。这是一个里程碑似的研究。从那以后，辐射诱导旁效应受到了辐射研究人员的极大关注。到目前为止，大量的体内（6、7、8、9、10）、体外（11、12、13）证据证实了旁效应现象的存在。而且除了在正常细胞中外，在肿瘤细胞中也观察到了辐射诱导旁效应的现象（14、15、16、17、18、19、20）。最近的研究（21）甚至显示旁效应可以引起直接受照射肿瘤细胞的存活能力下降。这提示了辐射诱导旁效应在临床肿瘤放射治疗中的一个应用潜能。放射生物学中传统的 DNA 标靶理论认为电离辐射只有造成直接的 DNA 损伤才会导致细胞死亡或基因突变，并且辐射生物学效应依赖于辐射沉积在细胞中的能量。但是这种辐射诱导旁效应现象和基因组不稳定性及适应性等现象的存在对该理论和以该理论为基础建立的线性无阈假说提出了质疑，因此可能改变在低剂量区域电离辐射致癌风险与剂量的线性关系。也正因为如此，对于旁效应的研究成为了放射生物学领域的一个非常重要的研究热点。
虽然大量的实验证据证实了辐射诱导旁效应的存在，但是到目前为止辐射诱导旁效应的分子机制仍然不是很清楚。已有研究显示细胞间的间隙链接（7、8）可溶性的信号因子如细胞因子（22）和氧化还原性代谢（9、23）等均可介导旁效应的发生。细胞因子中除了诸如白介素 6、白介素 8、白介素 33 和肿瘤坏死因子α（24）等，转化生长因子β1 也被证实参与了辐射诱导旁效应的介导过程（19、20、25、26）。例如，文献报道在 T98G 细胞中加入 TGF-β1 的抑制剂可以消除以微核形成和细胞存活能力为指标的辐射诱导的旁效应现象（19、20）。这些研究指出细胞受照射后释放出的TGF-β1 可作为一种信号因子作用于旁效应细胞从而引起旁效应细胞中的自由基形成，最终导致旁效应细胞的 DNA 损伤（19）。但是，TGF-β1 是如何介导辐射诱导旁效应这一过程到目前仍然不清楚。Nagasawa 和 Little 等人最先提出活性氧（ROS）参与了辐射诱导旁效应这一过程（5）。从那以后，一系列的研究都证实 ROS 在辐射诱导旁效应中发挥着重要的作用（23、27、28、29、30）。但是除过氧化氢等外，大多数的 ROS（例如羟基自由基）的半衰期和传播路径都很短（29）。一些研究指出受照射细胞可以引起旁效应细胞中ROS 水平的增加，从而提出氧化应激在旁效应细胞中发挥着重要的作用（27、29）。Iyer R 等人曾报道经过α粒子照射的细胞可以释放 TGF-β1 到培养液中，并作用于未受照射细胞使其胞内ROS水平升高、TP53和 CDKN1A 表达水平下降（26）。但是 TGF-β1和 ROS 之间具体的调节方式目前仍不清楚。另外，目前有研究者提出旁效应现象是表观遗传介导的（31、32、33）。在包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、小 RNA 相关沉默在内的所有表观遗传学改变中（13）多项研究证实了微小 RNA（miRNA）表达谱在旁效应细胞或组织中的改变（23, 26），这提示 miRNA 可能在辐射诱导旁效应中发挥调节作用。但是通过敲低 miRNA 的表达，Dickey 等人（38）发现与对照组相比，miRNA 敲低细胞组的旁效应细胞中γ-H2AX（DNA 损伤的一个替代标志物）的水平并没有改变。这项研究认为虽然 miRNA 在辐射诱导旁效应中发生了改变，但是它并非主要的信号因子，对旁效应现象的产生并无调节作用。然而，miRNA 到底是旁效应现象的一个结果还是参与旁效应现象调节的一个重要信号因子仍然需要进一步的研究。
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第一章 X 射线在 H1299 细胞中诱导旁效应现象的研究
电离辐射旁效应是指由受照射细胞引起其周围未受照射细胞发生一系列的生物学变化。1992 年 Nagasawa 和 Little 发现在低剂量辐射下，当仅仅有 1%的细胞核受到α粒子照射时，却有 30%的细胞发生了姊妹染色单体互换率的增高（5）。自此以后，电离辐射旁效应这一现象受到了人们的极大关注，因为它质疑了放射生物学中传统的DNA 靶标理论。到目前为止，无论是在体内还是体外，正常细胞还是肿瘤细胞中都证实了电离辐射旁效应的存在。为了证实 X 射线可在 H1299 细胞中诱导经培养液介导的旁效应现象，本研究采用培养液转移法转移条件培养液，用克隆形成实验测定经条件培养液处理过的旁效应细胞的克隆形成能力；采用结晶紫实验法和流式细胞术检测旁效应细胞的增殖和细胞周期分布情况；采用 53BP1 免疫荧光染色和 DNA 氧化性损伤实验来观察旁效应细胞的 DNA 损伤情况。
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2 实验方法
H1299 细胞以适当比例接种于含有 10%胎牛血清、2.5 g/l 葡萄糖、1 mM 丙酮酸钠、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素以及 1 mM HEPES（pH 7.2）的 RPMI1640培养液中，放置于 37℃、含 5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液。当细胞在培养皿中生长到约 70-80%汇合时，去除培养皿中的培养液，用 PBS 清洗两遍，加入1 ml 胰蛋白酶消化液，放入培养箱中，37℃消化 5 分钟，此时在显微镜下可以观察到细胞收缩变圆甚至脱落，加入新鲜培养液终止消化，用移液枪轻轻吹打以使细胞脱落并形成单细胞悬液，用血球细胞计数器进行细胞计数，取所需数量的细胞接种于新的培养皿中。冻存时，取对数生长期的细胞，去除原培养液，PBS 清洗两遍，胰蛋白酶消化形成单细胞悬液，加入新鲜培养液终止消化，并吹打混匀计数，1000 rpm、5 min 离心去除上清液，加入适量含有 20%胎牛血清、10%DMSO 的 RPMI1640 冻存液以使每毫升冻存液中含有 100 万个细胞，取 1 ml 此细胞悬液加入到 1.5 ml 的冻存管中，置于4℃冰箱 2 h，-20℃冰箱 3 h，-80℃冰箱 24 h，然后转入液氮罐中长期保存。复苏细胞时，从液氮罐中取出冻存管，将其迅速置于预先准备好的 37℃恒温水浴锅中，使细胞悬液在尽可能短的时间内解冻。将解冻后的细胞悬液移至离心管中，再加适量新鲜培养液以稀释细胞悬液，1000 rpm、5 min 离心去上清，用含有 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养液重悬后移至培养皿中培养，第二天换液。
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第三章 X 射线诱导 H1299 细胞旁效应现象的后果.....41
1 材料和仪器...... 41
2 实验方法.... 42
3 实验结果.... 43
4 讨 论........ 47
结 论....50
第三章X 射线诱导 H1299 细胞旁效应现象的后果
近年来有证据显示电离辐射诱导的旁效应和适应性之间可能存在关联。辐射诱导的旁效应细胞在受到大剂量照射时与适应性现象中的细胞预先受过小剂量照射一样变得具有抗性（58）。相反地，预先给予旁效应细胞一个低剂量照射可使旁效应不再出现（59）。然而这样的关联并非具有普适性。例如，研究发现辐射诱导的 H460 和 A549旁效应细胞的辐射敏感性反而增加了（60）。这些看似矛盾的结果表明深入研究旁效应和适应性之间的关系将有助于对这些现象分子机制的理解。 另外本研究已经证实辐射可以诱导 H1299 细胞旁效应现象的产生，并且证实了 TGF-β1-miR21-ROS 通路在这一旁效应现象中发挥着重要的作用。但是 TGF-β1 是否也在适应性中发挥重要作用却鲜有报道。另外，锰超氧化物歧化酶（SOD2）被发现参与了传统适应性反应的发生（61）。因此本研究以 H1299 人非小细胞肺癌细胞为研究对象，研究辐射诱导的旁效应细胞是否存在适应性的现象，并探讨 TGF-β1 信号通路和 SOD2 在此过程中可能发挥的作用。采用培养液转移的方法得到辐射诱导的旁效应细胞，用克隆形成实验检测旁效应细胞受照射后的适应性反应，用 Western Blotting 检测旁效应细胞中SOD2 的表达变化。
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结 论
1、在细胞DNA损伤、细胞增殖、细胞周期这三个生物学指标上可以观察到辐射在H1299细胞中诱导的经培养液介导旁效应的产生，并且此旁效应的产生依赖于照射后的时间。1 h RCM导致H1299旁效应细胞DNA损伤（53BP1 foci）增加，细胞DNA的氧化性损伤增加。18 h RCM诱导H1299旁效应细胞G2期阻滞从而导致细胞增殖速度减慢。
2、信号细胞和旁效应细胞中的TGF-β1通路对旁效应现象的产生同样重要。1hRCM可以导致旁效应细胞中ROS水平增加，并且此旁效应细胞中ROS水平的增加依赖于激活的TGF-β1通路。1 h RCM导致旁效应细胞中的miR-21表达升高，18 h RCM导致旁效应细胞中的miR-21表达降低；并且旁效应细胞中miR-21水平的改变受信号细胞和旁效应细胞中激活的TGF-β1通路的调控。在辐射诱导H1299旁效应现象中，miR-21不仅是旁效应的一个结果，更是一个非常重要的调控因子。
3、1 h和18 h未照射条件培养液和照射条件培养液培养的H1299旁效应细胞受照后可产生适应性反应，并且TGF-β1信号通路对该适应性有重要调控作用，而SOD2可能未参与这个过程。
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参考文献（略）