第一章前言
1.1中医药的抗癌作用
中草药用于治疗包括癌症在内的各类疾病己有数千年之久。“癌症” 一词最早出现在商代(公元前6-11年),在古代的医疗文献中,早有关于癌症的病因、病名以及治疗方法的描述,例如乳岩(即乳腺癌)、肾岩(又称肾岩翻花,即龟头癌)、舌岩(即舌癌)、噎購(即食道癌)、症瘕积聚(各种腹部肿瘤或转移癌)、恶拖(即皮肤癌)、瘿瘤(即淋巴癌或转移癌)、鼓胀(癌症并发腹水)、癃闭(尿路肿瘤)等等。中医治疗癌症现在己经被国内外医疗专家广泛的认可,大量的临床试验及科研研宄己经证实了中医治疗癌症的效果。
1.1.1辅助化疗,减小毒副作用,提高机体免疫力
近几年来,化疗是癌症的主要治疗手段之一,但目前所用的抗癌化疗药物都有不同程度的毒副作用,化疗药物在杀伤癌细胞的同时也对人体正常细胞具有杀伤作用。中药复方配合化疗可提高了临床疗效,提高了肿瘤患者的生存质量,并有效地减轻了毒副作用。一项随机的双盲安慰剂实验证实,中药作为辅助疗法可以显著地降低由化疗引起的恶心等症状。另一项随机试验证明,中药辅助化疗可以减轻疼痛症状,延长病人的存活时间。红景天可以改善乳腺癌病人化疗引起的口腔點膜炎。补中益气汤改善癌症病人的疲劳。修正的四君子汤可以减轻化疗引起的白细胞减少、恶心以及呕吐等症状。人对养肺消瘤汤联合GP化疗方案(吉两他滨+顺祐)治疗IIIB期、IV期非小细胞肺癌的疗效进行了观察研究,结果表明抗肿瘤中药与化疗联合应用具有增效减毒的作用。吴镟等发现左归丸加黄苗对化疗后小鼠卵巢生殖内分泌功能的损害具有保护作用,并可增强化疗的治疗效果。肝动脉拴塞化疗联合解毒方可以有效地延长肝癌病人的生命,从5.87个月增加到9.2个月。对于晚期乳腺癌,多草本注射剂-参苗扶正方可以缓解化疗带来的骨痛,延长生命,增强化疗疗效。参民扶正注射液也可以对晚期肺癌病人有明显的疗效。
化疗通过率可间接反映患者对化疗的耐受性和依从性。患者耐受性或依从性差,会影响整个综合治疗计划,从而影响肿瘤治疗的疗效。因此,如何提高化疗通过率及减少延迟化疗率在肿瘤治疗领域中越来越引起人们的重视。中医药联合化疗在减毒增效、提高中晚期非小细胞肺癌患者的生存质量方面有一定优势。..............
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第二章材料与方法
2. 1实验材料
2.1.1细胞
实验所用的转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞(HEK293T)、肝癌细胞(Hep3B)、肝癌细胞(HepG2)和前列腺癌细胞(PC3)均为兰州大学肿瘤生物学和药物蹄选研究所保存,上述细胞均用含有10%胎牛血清的DMEM培养基中置于37°C含有5%C02的培养箱中培养。传代使用含有0.25%胰酶和0.02%EDTA钠盐的溶液消化。
2.1.2相关生物试剂
DNAladder购自Fermentas公司:X-gal、ONPG和谅脂糖购自上海生工;SDS、EDTA、EB、TritonX-]00、Tris Base 均购自 Promega 公司;Yeast extract 琼脂和Tryptone购自OXOID公司;细胞培养所用胎牛血清购自Hydone公司;稳定型突光素酶报告基因检测试剂盒(ONE-Glo Luciferase Assay System)购自Promega公司;胰酶、青霉素、MTT、TPCA-K DMEM和链霉素购自Sigma公司;结晶紫染料购自碧云天公司;细胞因子TNF-ct购自Pepro Tech公司;抗IicBouPhosphorlation-IicBa、Phosphorlation-p65、p65、cyclinDl、CDK4> CD1C6、c-myc的抗体均购自CST公司。
2. 2方法
2.2.1苳甲抗癌复方有效成分的分离提取。
取10剂等甲抗癌复方药材,复方提取工艺流程提取,等甲抗癌复方药材与水1:8混合,煮沸60min,趁热滤过,滤液浓缩,然后用45%乙醇萃取。得到上清液A和沉淀物B后,分别收集和保留。沉淀部分沉淀物B继续用45%乙醇提取,上清液和沉淀物分别收集和保留,分别命名为LAM-1和LAM-2;上清液部分清液A则由80%的乙醇提取,沉淀和上清液分别收集和保留,分别命名 LAM-3 和 LAM-4。
2.2.2样品制备
分别称取等甲抗癌复方提取组分粉末LAM-1 (生药量33.4g/g)、LAM-2 (生药量52.6g/g)、LAM-3 (生药量18.7g/g)和LAM-4 (生药量11.2g/g)溶于去离子水中,浸泡30min,滤液12000rpm/min离心lOmin,取上清液,各组分配成生药量为0.56〗g/ml提取液,0.22^101滤膜过滤除菌,4°C保存备用。
2.2.3基于NF-KB为鞭点高通量蹄选系统蹄选等甲抗癌复方有效组分
1)取培养至对数生长期的PC3-NF-KB-luciferase细胞按1 x 104接种于96孔板中,培养24h使细胞汇合度达到70%。
2)实验设空白对照组、等甲抗癌复方组和TPCA-l阳性对照组,于37°C,继续培养24h。
3)处理时间结束后,每孔加入的ONE-Glo Lucifciferase突光素酶底物,室温避光解育lOmin后于能酶标仪GENios(TEcAN)下测定焚光素酶的活性,记录数据。
2.2.4细胞增殖实验检测等甲抗癌复方提取组分对癌细胞增殖的影响
2.2.4.1 MTT 法
1)取培养至对数生长期的HepG2细胞和Hep3B细胞按1><104接种于96孔板中,培养24h使细胞汇合度达到70%。
2)实验设空白对照组、等甲抗癌复方组和TPCA-1阳性对照组,于37°C,继续培养24h。
3)处理时间结束后,每孔加入MTT(5mg/ml) 20μ1,继续培养4h后弃去培养基,每孔加入200μ1DMSO,室温避光震荡l0min以充分溶解紫色结晶。...............
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第三章实验结果..........................................................17
3.1初步筛选抑制NF-KB活性的LAM有效组分..............17
3.2.LAM-4抑制NF-KB的组成型活化.............................19
3.3 LAM-4抑制TNF-a诱导的NF-KB活性......................19
3.4 LAM-4抑制TNF-a诱导的p65核转位........................19
3.5 LAM-4抑制细胞增殖以及下调
癌基因c-myc和存活蛋白Survivin的表达.......................21
3.6 LAM-4将HepG2细胞周期阻滞在G0/G1期................22
第四章讨论..................................................................24
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结论
1.LAM-4抑制依赖NP-KB信号通路的萤光素酶活性并且具有较低的细胞毒性。
2. LAM-4抑制组成型活化的IkB-oi (Ser-32)和p65 (Ser-536)磷酸化以
及TNF-a诱导的p65(Ser-536)磷酸化、p65核转位和IkB-cx降解。
3. LAM-4抑制细胞增殖并下调c-myc和Survivin的表达。
4. LAM-4 使 HepG2 细胞阻滞于 G0/G1 期,并下调 cyclinDl,CDK4以及CDK6的表达,同时促进p21的表达。
传统中药生物活性成分的分析和蹄选是一个非常艰巨的任务。但是,现代分析和分离的方法的快速发展为我们研究中国传统中药提供给了便利的条件。本文利用基于NF-kB祀点的高通量蹄选系统蹄选等甲抗癌复方四种提取组分,并得到苳甲抗癌复方有效组分:LAM-4。LAM-4抑制NF-KB信号通路以及下游基因包括周期蛋白cydin D1和细胞增殖蛋白c-myc的表达,最终致使肝癌细胞周期逃逸,将细胞阻滞在G0/G1期。
中药复方依赖复杂多样的化学成分,起到有主次的多祀点、有机的整体协同的治疗效果。现阶段,我们只是针对NF-KB信号通路研宄等甲抗癌复方的有效成分和其抗癌作用机理。在后续研究中,通过己构建的各类高通量蹄选系统,对抗肝癌复方各组分进行全面的蹄选,在细胞水平上综合分析蹄选成分的活性。还将进一步通过基于NF-KB IE点的高通量蹄选系统和高效液相色谱技术蹄选LAM-4中有效成分,更加细致的研宄等甲抗癌复方抗肿瘤活性。本文利用基于NF-kB祀点的高通量蹄选系统首次对苳甲抗癌复方的提取组分进行高通量蹄选,获得具有活性的有效组分,并阐述复方中活性有效组分的抗癌作用机理。将高通量蹄选技术和中药相结合,以中药为蹄选源进行药物蹄选,对于探讨中药的作用机理和有效成分具有十分积极的意义,为中药复方有效组分及其作用机制的研究提供新的思路。
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