1材料和方法
1. 1实验动物分组
健康雄性助基因敲除小鼠18只,C57 BL/6J小鼠18只,均12周龄,体质量17-20 g,分别购自北京大学医学部实验动物中心和第四军医大学实验动物中心。小鼠于清洁级环境中分笼饲养,分别随机分为4组(每组9只):①正常对照组(CON组):C57BL/6J小鼠普通饲料加生理盐水灌胃6周;②单纯药物干预组(CON + LXR组):C57 BL/6J小鼠高脂饲料加T-0901317溶液灌胃6周;③模型组(AS组):助基因敲除小鼠高脂饲料加生理盐水灌胃6周;. LXR激动剂组(AS +LXR组):助of基因敲除小鼠高脂饲料加T-0901317溶液灌胃6周。T-0901317以无水乙醇溶解,灌胃时配制成水溶液(乙醇浓度<0. 5 ml/L ),药物剂量10 mg/(kg·d)。
1.2主要试剂和材料
T-0901317进口LXR激动剂),购于美国Cayman公司;胆固醇粉,成都科龙公司;兔ABCAl多克隆抗体,购自美国Abcam公司;HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体,购自上海麦约尔生物技术有限公司;BCA试剂盒(美国Pierce ) ;loading buffer( BD Biosciences,美国),高脂饲料,在普通颗粒饲料中添加12. 5扩kg胆固醇、150扩 kg脂肪。
1.3主要仪器和设备
冰冻切片机,美国;恒宇牌电热恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂;光学显微镜,日本Olympus;Olympus Au2700全自动生化分析仪,日本;动物天平UX4200S,日本岛津公司;透射电镜JEM-2000EX,日本JEOL公司。
1.4动物标本的采集与处理
饲养结束后,小鼠以乙醚麻醉,眼眶毛细玻璃管取血300μl,离心分离血清,置一20℃保存。取各组胸主动脉根部标本,一部分一70℃冰箱保存,进行Western blot检测,一部分清洗后以25 ml/L戊二醛固定后用于常规形态学和电镜检测。
1.5血脂检测血脂采用
Olympus Au2700全自动生化分析仪检测(第四军医大学西京医院检验科),包括总胆固醇(TC)、三酞甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C )。小鼠体质量使用动物天平UX4200S测定。
1.6透射电镜样本制备及观察
实验结束时,分别取各组动物新鲜主动脉1 cm x 0. 2 cm,清洗后用25 ml/L戊二醛固定,脱水,超薄切片,用JEM-2000EX透射电镜观察主动脉内膜超微结构变化并拍照。
1.7主动脉壁中ABCAl表达的检测
主动脉根部标本,清洗后剥离血管外附着的结缔组织,剪碎,每1 mg动脉血管组织加人5闪预冷的蛋白裂解液进行组织匀浆,后于1 000-2 000 r/min离心8min,冰内存放30 min,取上清,于4℃离心机12 000 r/min离心10 min,取上清,用BCA试剂盒测定蛋白含量。剩余蛋白样品按照1:1比例加人loading buffer,置于100℃水中煮沸10 min变性。ABCA1检测每道取20μg总蛋白上样,先在120 mV '恒压下电泳25 min,再在160 V恒压下继续电泳至澳酚蓝到达凝胶底部为止。将膜和滤纸浸泡于转移缓冲液中,安装好转移装置,将其置于冰中,在100 mV恒压下转膜150 min,将蛋白转移至NC膜上。50 g/kg脱脂奶粉封闭1h后,ABCA1多克隆抗体(1 : 500)和Tublin单抗(1 : 1 000 ) 4C孵育过夜。次日取出室温复温30 min,PBS洗10 min x 3次,羊抗兔二抗(1:5 000 )室温下孵育90 min,PBS洗10 min x 4次。配制发光底物缓冲液,膜上滴加显迹液室温0. 5-3 min至见发光条带,压片,显影,定影,自来水冲洗,晾干,标记。用凝胶图像分析系统进行扫描分析,测量各阳性条带的灰度,测得的ABCA1阳性条带灰度与相应的Tublin条带灰度比值作为其蛋白的表达量。
1.8统计学处理数据
均以x1:表示,采用SPSS12. 0统计软件包,多组间比较使用单因素方差分析( One-way ANOVA ),组间比较采用LSD-t检验(LSDt-test )。以P,O. OS为差异具有统计学意义。
2结果
2. 1各实验组血浆主要脂质成分的比较
实验结束后4组小鼠的体质量无显著性差异。AS组、AS+ LXR组小鼠TC , LDL-C明显高于CON组、CON+AS组(P<0.01),AS+LXR组小鼠TC , LDL-C明显低于AS组(P<0.01),AS+LXR组小鼠HDL-C明显高于AS组(P<0.05),AS组HDL-C低于CON组(P<0.01),AS +LXR组小鼠TG明显高于CON组、AS组(P<0.01,)。
2. 2动脉超微结构的改变
取主动脉近根部进行横切,CON组和CON + LXR内皮正常,层次清晰。AS组可见动脉内皮脱落,内膜广泛而明显的增厚、纤维化,突向管腔,斑块内含有大量的泡沫细胞(黑色三角),移行的平滑肌细胞(红色箭头)和条状的胆固醇结晶(黄色箭头),同时有纤维组织增生伴点片状钙化,中膜平滑肌明显萎缩;AS + I,XR组主动脉壁层次欠清晰,内膜虽有明显增厚,但泡沫细胞,移行的平滑肌细胞和胆固醇结晶明显减少,病变程度与模型组相比有显著的降低。CON组和CON +LXR组,内皮正常,层次清晰。AS组可见斑块内含有大量的泡沫细胞(黑色三角),移行的平滑肌细胞(红色箭头)和条状的胆固醇结晶(黄色箭头);AS +LXR主动脉壁层次欠清晰,内膜虽有明显增厚,但泡沫细胞,移行平滑肌细胞和胆固醇结晶明显减少。
3讨论
LXR是配体活化的转录因子,属于核受体超家族,有两个亚型LXR。和LXRp,均为涉及脂肪代谢基因的中心调节因子。LXR。主要在肝脏、肾脏、巨噬细胞和肠中表达,而LXR(3在全身表达。LXR的靶点基因包括促进胆固醇释放的ABC转运子(AB-CAI,ABCG1和ABCG4),HDL调节蛋白以及涉及胆固醇向胆汁中分泌的基因(CYP7A, ABCGS和ABCGB)。本研究发现LXR激动剂可以显著降低TC , LDL-C,升高HDL-C,其中升高TG和国外文献中报道的一致,是其副作用,因为研究表明肝脏中CD36是LXRs的靶基因,LXRs可直接上调CD36的表达,CD36在肝脏摄取脂质,进而导致脂肪堆积和血浆中TG水平的升高,严重可引发用旨肪变性。同时LXR激动剂对助基因敲除小鼠AS的主动脉内膜超微结构有良好的修复和保护作用。当胆固醇的量超出了细胞储存能力,过多胆固醇会转运至血浆而减轻细胞负荷。血浆中的胆固醇则通过逆转运途径运回肝脏。膜ATP结合盒(ATP-binding cas-sette , ABC )转运蛋白首先将细胞游离胆固醇转运至高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL),然后再由HDL将胆固醇运回肝脏。此转运过程对内皮细胞和巨噬细胞尤为重要,因为这两种细胞经常暴露于大量的街醇中。
胆固醇外流及逆转运对维持机体和细胞胆固醇内稳态具有重要意义,其中起关键作用的是ABCA1蛋白。ABCA1基因是LXR的靶基因—LXR激动剂可提高ABCA1基因启动子活性,使其表达上调。
有研究表明,选择性的使巨噬细胞ABCA1基因功能缺失,在没有改变血脂的情况下,可使小鼠AS病变的程度加重。相反,使人的ABCA1基因在AS小鼠中大量表达,则可明显抑制AS病变的形成。
以上研究均提示,ABCA1在抑制AS病变形成方面可能发挥着重要作用。有动物实验证明,口服LXR激动剂GW3965和RXR激动剂LG268均使ApoE-和LDL一小鼠的AS面积明显减少,其中GW3965在疾病模型动物实验中除了展示能明显延缓AS病程外,在引发脂肪肝的毒副作用上并不明显。本实验结果表明,ABCA1基因的过度表达可促进胆固醇和磷脂的外流,增加血浆胆固醇、胆固醇脂、HDL-C等的浓度。ABC胆固醇转运蛋白活化后可以促进胆固醇从细胞内向细胞外转运,而防止AS斑块的发生。因此ABCA1基因是调节细胞内胆固醇外流关键的限速基因。ABCA1基因突变可导致细胞内胆固醇和磷脂不能转运至贫脂或无脂的ApoAl,导致新合成的ApoAl迅速降解、HDL生成不足、外周细胞胆固醇严重沉积,促进AS发生和发展。
以上研究均提示,ABCA1在抑制AS病变形成方面发挥着重要作用。在AS病变中的巨噬细胞有大量的ABCA1 mRNA表达,可能为AS组织中巨噬细胞对脂质超负荷的反应性增加所致,与ABCA1在炎症细胞中的胆固醇转运作用相一致;而一些晚期AS斑块内的巨噬细胞没有ABCA1的表达,这可能与这些巨噬细胞ABCA1调节途径遭到破坏导致缺少信号输人或对信号缺乏反应有关。
本实验表明,LXR激动剂T-0901317有调脂,保护血管内皮,减轻助基因敲除小鼠AS病变程度的作用。可促进动脉壁中ABCA1的表达,提示LXR激动剂还可通过直接促进巨噬细胞和内皮细胞中ABCA1表达,发挥其抗AS效应。本研究为LXR激动剂用于临床防治AS提供一定的实验依据。