一、材料和方法
1 实验动物
雄性 WISTAR 大鼠 2 周龄 3 只，2-3月龄 25 只，质量 (250±20)g，由本院实验动物中心提供。
2 主要仪器及试剂
CO2气体恒温培养箱 ( 美国Thermo electron 公司 )，超净工作台 ( 北京半导体设备一厂 )，倒置相差显微镜 ( 日本 Olympus 公司 )。HX-200 动物呼吸机 ( 成都泰盟科技有限公司 ) ；Rm6240C 型生理实验系统 ( 成都仪器厂 )；OLYMPUS IX71 自动显微照相系统 (Olympus，日本 )。α-MEM 培养基 (Hyclone，USA)，特级筛选胎牛血清 (Hyclone，USA)，胰酶 (Amresco，USA)，Percoll(Pharmacia，USA，比重为 1.073g/L)。过氧化物酶标记的原位细胞凋亡检测试剂盒 (TUNEL)。
CO2气体恒温培养箱 ( 美国Thermo electron 公司 )，超净工作台 ( 北京半导体设备一厂 )，倒置相差显微镜 ( 日本 Olympus 公司 )。HX-200 动物呼吸机 ( 成都泰盟科技有限公司 ) ；Rm6240C 型生理实验系统 ( 成都仪器厂 )；OLYMPUS IX71 自动显微照相系统 (Olympus，日本 )。α-MEM 培养基 (Hyclone，USA)，特级筛选胎牛血清 (Hyclone，USA)，胰酶 (Amresco，USA)，Percoll(Pharmacia，USA，比重为 1.073g/L)。过氧化物酶标记的原位细胞凋亡检测试剂盒 (TUNEL)。
3 MSC 的分离、培养及鉴
2 周龄 Wistar 大鼠2只，断颈处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨内骨髓。1.073g/L Percoll 分离液密度梯度离心+ 贴壁培养法分离并纯化原代MSC，用含10%筛选胎牛血清的α-MEM培养基、37℃、饱和湿度、5%CO2的条件培养。待细胞 80% 融合生长后胰蛋白酶消化法按 1：3 进行传代。按文献报道方法对所培养细胞体外诱导向脂肪、成骨分化，14 天后 Oil Red O 染色检测脂质沉积，Van kossa 染色鉴定成骨细胞分化能力。本研究采用第 3-5 代细胞进行实验研究。
2 周龄 Wistar 大鼠2只，断颈处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨内骨髓。1.073g/L Percoll 分离液密度梯度离心+ 贴壁培养法分离并纯化原代MSC，用含10%筛选胎牛血清的α-MEM培养基、37℃、饱和湿度、5%CO2的条件培养。待细胞 80% 融合生长后胰蛋白酶消化法按 1：3 进行传代。按文献报道方法对所培养细胞体外诱导向脂肪、成骨分化，14 天后 Oil Red O 染色检测脂质沉积，Van kossa 染色鉴定成骨细胞分化能力。本研究采用第 3-5 代细胞进行实验研究。
4 动物模型及实验分组用结扎左前降支的方法
建立成年WISTAR大鼠急性心肌梗死(AMI)模型。常规 2% 戊巴比妥钠 50mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，结扎左前降支近段建模，假手术组仅穿线不结扎。结扎后30min 随机分为 AMI 组、MSC 组，每组 10 只 ；另取 5 只行假手术作为对照 (SHAM 组 )。其中 SHAM组、AMI 组于心梗后心肌内注射 PBS 0.1ml ；MSC组于急性心梗 30min 后分 4 点于梗死边缘区心肌内注射第 3-5 代大鼠 MSC 1×106/0.1ml，检查无活动性出血后关胸，青霉素 20 万单位腹腔内注射预防感染，分笼饲养。
建立成年WISTAR大鼠急性心肌梗死(AMI)模型。常规 2% 戊巴比妥钠 50mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，气管插管，小动物呼吸机辅助呼吸，结扎左前降支近段建模，假手术组仅穿线不结扎。结扎后30min 随机分为 AMI 组、MSC 组，每组 10 只 ；另取 5 只行假手术作为对照 (SHAM 组 )。其中 SHAM组、AMI 组于心梗后心肌内注射 PBS 0.1ml ；MSC组于急性心梗 30min 后分 4 点于梗死边缘区心肌内注射第 3-5 代大鼠 MSC 1×106/0.1ml，检查无活动性出血后关胸，青霉素 20 万单位腹腔内注射预防感染，分笼饲养。
5 超声心动图检查
手术后 72h 检测大鼠超声心动图。大鼠麻醉后前胸剃毛，仰卧固定，用频率为 10MHz 的超声探头，置于大鼠胸骨左缘第 4、5肋间，显示 M- 型超声图像，测量左室舒张末期
手术后 72h 检测大鼠超声心动图。大鼠麻醉后前胸剃毛，仰卧固定，用频率为 10MHz 的超声探头，置于大鼠胸骨左缘第 4、5肋间，显示 M- 型超声图像，测量左室舒张末期
和收缩末期内径、室间隔及左室后壁厚度，由仪器自动计算左室缩短分数 (LVSF)、左室射血分数(LVEF)。
6 血流动力学检测
连接 8 导生理记录仪，压力示波模块连接充满肝素生理盐水的 PE-50 导管，调定零点。大鼠超声心动图检查后，固定于手术台，颈部脱毛，切开颈部皮肤，钝性分离右颈动脉，结扎右颈动脉远心端，近心端插入导管，实时记录主动脉及左心室压力曲线，并测量主动脉收缩压、舒张压、左心室收缩压 (LVSP)、舒张末压 (LVEDP) 及 ±dp/dtmax，将 ±dp/dtmax 与 LVSP相比作为校正值。每条曲线选择 3 个区域进行测量，取其平均值作为最后测量结果。平均动脉压(MAP)= 舒张压 +1/3( 收缩压 - 舒张压 )。
连接 8 导生理记录仪，压力示波模块连接充满肝素生理盐水的 PE-50 导管，调定零点。大鼠超声心动图检查后，固定于手术台，颈部脱毛，切开颈部皮肤，钝性分离右颈动脉，结扎右颈动脉远心端，近心端插入导管，实时记录主动脉及左心室压力曲线，并测量主动脉收缩压、舒张压、左心室收缩压 (LVSP)、舒张末压 (LVEDP) 及 ±dp/dtmax，将 ±dp/dtmax 与 LVSP相比作为校正值。每条曲线选择 3 个区域进行测量，取其平均值作为最后测量结果。平均动脉压(MAP)= 舒张压 +1/3( 收缩压 - 舒张压 )。
7 梗死面积及心肌细胞凋亡比例检测
完成上述测定后，经右颈动脉注入 10% 氯化钾 2ml，使心脏停搏于舒张期，开胸取出心脏，用 PBS 洗去血液，并用滤纸吸去水分，沿室间隔剪去右心室 ( 不包括室间隔 )，在心脏长轴中点处垂直于长轴将左心室一分为二，心尖半石蜡包埋，5μm 厚切片行 Masson 三色染色用 OLYMPUS IX71 自动显微照相系统及微机图像分析系统测定疤痕弧长以及心内膜和心外膜周长，计算心肌梗死面积。取上述石蜡切片，按说明书操作行细胞凋亡 TUNEL 检
完成上述测定后，经右颈动脉注入 10% 氯化钾 2ml，使心脏停搏于舒张期，开胸取出心脏，用 PBS 洗去血液，并用滤纸吸去水分，沿室间隔剪去右心室 ( 不包括室间隔 )，在心脏长轴中点处垂直于长轴将左心室一分为二，心尖半石蜡包埋，5μm 厚切片行 Masson 三色染色用 OLYMPUS IX71 自动显微照相系统及微机图像分析系统测定疤痕弧长以及心内膜和心外膜周长，计算心肌梗死面积。取上述石蜡切片，按说明书操作行细胞凋亡 TUNEL 检
测，DAB 显色，苏木素复染。每张切片在高倍镜下 (×400) 梗死边缘区随机选取 8 个视野，计数凋亡细胞数及正常细胞数，以其比值作为每只动物的细胞凋亡率 (%)。
8 统计学分析
用 SPSS 12.0 统计软件处理。所有计量资料以-x±s 表示，分类变量以百分比表示。组间比较采用 One-way ANOVA 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。
用 SPSS 12.0 统计软件处理。所有计量资料以-x±s 表示，分类变量以百分比表示。组间比较采用 One-way ANOVA 检验。P<0.05 表示差异有统计学意义。
二、结果
1 MSC 的形态学观察 原代分离的 MSC 呈圆形，次日始部分贴壁生长，长梭形、三角形或多边形，多为单个细胞散在生长 ；第 3-5 天细胞增殖迅速，呈放射状集落生长 ( 图 1A 为原代 MSC 集落 ) ；第7-10d80% 以上细胞呈融合生长，此时进行传代培养。传代后的 MSC 形态上更加趋于一致，为成纤维细胞样，生长旺盛，每隔 2-3 天传代 1 次 ( 图1B 为第 3 代 MSC)。所获得贴壁细胞经成脂肪分化诱导后，细胞内布满圆形透亮脂质空泡 ；应用 Oil Red O 原位染色后可见脂滴呈桔红色深染，说明有大量脂肪细胞生成 ( 图 1D)。成骨诱导第 10 天光镜下观察可见，大量扁平状成骨细胞形成，van kossa染色见棕黑色钙沉积结节。未分化组 Oil Red O( 图 1C) 及 van kossa 染色阴性 ( 图 1E)。间接证实培养的贴壁细胞为 MSC，具有体外成骨和成脂肪分化能力。
2 超声心动图
结果显示，与 SHAM 组相比，72h后 AMI 组及 MSC 组大鼠的 LVEF 及 LVSF 均显著减低 (p<0.05)，但 AMI 组及 MSC 组 LVEF 及 LESF相比无显著性差异 (p>0.05)。提示，心肌梗死后大鼠左心室功能显著减退，移植 MSC 早期左心功能改善不明显。
结果显示，与 SHAM 组相比，72h后 AMI 组及 MSC 组大鼠的 LVEF 及 LVSF 均显著减低 (p<0.05)，但 AMI 组及 MSC 组 LVEF 及 LESF相比无显著性差异 (p>0.05)。提示，心肌梗死后大鼠左心室功能显著减退，移植 MSC 早期左心功能改善不明显。
3 血流动力学
各组大鼠心率无显著差异。与SHAM 组相比，AMI 组和 MSC组 大 鼠 MAP、LVSP、±dp/dtmax 及 LVSP 校 正 的 ±dp/dtmax 均显著下降，LVEDP 显著增加 (P 均 <0.01) ；但 AMI及 MSC 组间比较无显著差异。上述结果提示，心肌梗死后大鼠血流动力学恶化，MSC移植早期对血流动力学无明显改善作用。
各组大鼠心率无显著差异。与SHAM 组相比，AMI 组和 MSC组 大 鼠 MAP、LVSP、±dp/dtmax 及 LVSP 校 正 的 ±dp/dtmax 均显著下降，LVEDP 显著增加 (P 均 <0.01) ；但 AMI及 MSC 组间比较无显著差异。上述结果提示，心肌梗死后大鼠血流动力学恶化，MSC移植早期对血流动力学无明显改善作用。
4 心 肌细 胞凋 亡率 结扎左前降支近段造成的心肌梗死面积二组无显著差异(40±2.1% vs. 39.9±3.1%，p>0.05)。TUENL 检 测 凋 亡的心肌细胞核呈深褐色着染，而正常非凋亡细胞和阴性对照组织被苏木素复染呈蓝色，核相对较大，形态大小较为一致。AMI 后 72h，与SHAM 组 相 比 ( 图 3A，3B)，AMI 组梗死区 ( 图 3C) 及缺血区 ( 图 3D) 心肌细胞凋亡率显著 增 加 ( 分 别 为 41.6±7.2%和 18.9±5.4% vs. 3.1±1.3%，P 均 <0.01) ；MSC 组 梗 死 区(28.3±2.8%， 图 3E) 及 缺 血区 (9.2±3.8%，图 3F) 心肌细胞凋亡率均较 AMI 组显著减少 (p<0.01)。
三、讨 论
缺血缺氧是心肌细胞发生凋亡的重要原因。本研究发现，心肌梗死后 72h，梗死区及梗死边缘缺血区均有相当比例的心肌细胞发生凋亡，以梗死区细胞凋亡比例最高。MSC 移植能显著减少这些区域心肌细胞凋亡比例，但血流动力学及心脏功能改善作用不甚显著，可能与急性心肌梗死早期大量心肌细胞坏死、炎症反应重，MSC 存活比例低、心功能代偿能力有限等多种因素有关。心功能的改善与此不一致的现象提示还可能存在其他的损伤修复机制。我们的结果与 Noiseux和 Gnecchi等报道不同，他们应用 Akt 基因修饰 MSC，不仅显著增加了移植 MSC 的存活、减少 MSC 凋亡比例 ；而且 Akt 通路的激活，也是 MSC 发挥心肌细胞保护作用的重要机制。可见，Akt 基因修饰扩大了 MSC自身的组织修复、旁分泌作用，这可能是其心功能改善作用较单纯应用 MSC 改善更显著的原因。
细胞凋亡是个复杂的过程，涉及多个凋亡途径、凋亡的危险因素及凋亡效应因子。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族成员，是多种细胞最终的凋亡蛋白酶。Bcl-2 家族在调控 caspases 的激活过程中起着重要作用。MSC 归巢或移植入心脏后能够抑制心肌细胞凋亡。Zachary 等研究发现，MSC 移植可以通过促进梗死部位血管新生并通过Ras 信号通路，激活 PI3K/Akt 信号途径、上调抗凋亡蛋白 Bcl-2 的水平发挥抑制心肌细胞凋亡的作用。Tang 等发现，自体 MSC 移植后，梗死区心肌细胞凋亡比例显著降低，且 Bcl-2 家族中促凋亡蛋白 Bax 的表达水平下降 60%，因此他们认为 MSC 可以通过分泌细胞因子、下调促凋亡蛋白等机制抑制心肌细胞的凋亡。此外，研究还发现，间充质干细胞通过旁分泌机制灭活心肌细胞释放的因子，从而抑制了凋亡信号的产生 ；同时促进细胞生存的信号通路来抑制细胞凋亡，减少心肌细胞的损失。MSC 还可能通过免疫调节或促进血管新生而产生抑制心肌细胞凋亡的作用。
综上所述，MSC 缺血心肌内移植早期能显著抑制梗死及缺血区心肌细胞凋亡，但并未显示出改善血流动力学、保护心功能的作用，这种心肌保护作用在远期心功能的维护中的作用及其机制有待进一步明确。
参考文献
1 边素艳，盖鲁粤，叶平，等．SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响［J］．军医进修学院学报，2010，31（3）：261-264．