藏药哇夏嘎的脑神经保护作用

第一章前言

各种因血管源性病变而导致的脑功能障碍被称为脑血管疾病。该病是世界目前三大主要导致人类死亡的原因之一，同时，在存活者当中，有50%~70%的患者遗留瘫痪、失语等严重残疾以及高达40%的复发率，该病己成为危害人类健康的第一杀手。在我国，随着社会进步，生活水平R新月异，饮食结构发生了巨大变化，人口老龄化加速及慢性病发病的年轻化，导致与全世界相比，CVD发病率在欧、美正逐年降低的情况下，我国还在呈现不断攀升态势；另外，我国CVD的复发率较欧美等国家明显偏高。2008年中华人民共和国卫生部发表的第三次死因回顾抽样调查主要情况显示，在我国，心脑血管疾病、恶性肿瘤和其他慢性退行性疾病成为我国城乡居民最主要的死亡原因，调查结果表明，脑血管病、恶性肿瘤是我国IT前居民死亡的前两位原因，分别占死亡总数的22.45%和22.32%,脑血管病的死亡率是欧美发达国家的4?5倍，是R本的3.5倍2012年，据卫生部最新统计显示，我国目前脑血管病发生率正以每年约9%的速率上升，轻化的趋势愈加明显，脑血管病己成为我国居民第一位的死亡原因。

脑卒中（stroke)是指由于急性脑循环障碍而引起局限性或弥漫性脑功能缺损综合症候群或称急性脑血管事件。相关流行病学研究表明，我国脑卒中的年发病率男性为89.60/10万?314.0/10万，女性为76.70/10万?212.20/10万，城市高于农村，男性高于女性，北方高于南方。中国每就会新发一位脑卒中病人，现存脑卒中患者约为700万之众，每年还有150万?200万新发脑卒中病人，其中约75%-85%为缺血性脑卒中（Ischemiastroke，IS),出血性脑血管病仅占20%左右缺血性脑血管病是由于脑血管壁病变或血流动力学障碍而引起的相应供血区脑组织由于缺血、缺氧，进一步导致脑组织软化、坏死，造成一系列神经功能缺损症候群，其中，短暂性脑缺血发作、脑梗死，又统称缺血性脑卒中。由于脑卒中具有“四高一多”的特点，即高发病率、死亡率高、致残率高、复发率高和多并发症。据调查，我国有75%的脑卒中患者丧失了劳动能力，40%导致了重度致残。孙迎春等人的研究结果证实，脑卒中的病程平均为4.7年，最长者为20年，大部分患者不仅无法工作，而且生活不能自理，需要家人分出大量时间、精力、物力、财力来照顾病人。...........

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第二章材料与方法

2,1实验材料

2.1.1实验动物
选取雄性健康级成年Wistar大鼠198只，鼠龄10周，体重区间为280?320g，实验室环境温度22土3°C，光周期12h，自由进食与饮水。

2.1.2实验试剂与药品

2.1.2实验试剂与药品
丙二醛(MDA)测定试剂盒Rabbit anti-rat MMP-9一抗TUNEL凋亡检测试剂盒红四氮吟<TTC)磷酸盐缓冲液(PBS>4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH7.4 )10%水合氯醛生理盐水蒸馏水硫酸庆大霉素免疫组化染色试剂盒DAB显色试剂盒硫酸庆大霉素2.1.3藏药哇夏嘎汤剂制备:藏药哇夏嘆采购自甘肃省甘南州藏医药研究所，共采购生药材500g，于兰州国医馆，经称重、浸泡、煎熬、浓缩而成汤剂，250ml，1ml煎液相当于生药2g。

2.1.4实验用溶液配制

 

2.1.4.1 碟酸故缓冲液（phosphate buffered solution.PBS )称取 15.6g NaH2P04.2H20、35.8gNa2HP04?2H20各加蒸馆水至1000mL溶解，分别配成A液和B液，取A液190mL、B液810mL，两种液体混合即为O.lmol/LPBS (调试pH至7.4)，4°C冰箱储存备用。

2.1.4.2 4%多聚甲酵磷酸盐缓冲液
称取42.11g多聚甲酵粉剂，溶于O.lmo丨/L (pH7.4) PBS 500mL中，搅拌并加热至60?65°C，加入Imol/LNaOH至溶液清澈，冷却后添加PBS至总体积为l000mL，过滤除杂，室温下保存。

2.1.4.3 红四氮哗
（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)称取含量为100%TTC 5g溶于245mL的蒸馈水中，配制成2%TTC溶液250mL,常温放置（使用前配制）。

2.1.4.4 10%水合氯酸
称取99.5%的水合氯醛l0g溶入lOOmL的蒸馈水中，用玻璃棒搅梓至溶解，配置成10%的水合氯醒，用于腹腔麻醉注射。

2.2实验方法

2.2.1实验动物随机分组及治疗组给药
将198只健康雄性Wistar大鼠，用随机分组的方法，分为假手术组、模型组和治疗组（哇夏嘆治疗组），其中模型组和治疗组再分为脑缺血2h后再灌注6h、24h、48h、72h和120h，共11个亚组，每亚组18只大鼠。釆用改良线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型，造模成功后Ih即脑缺血Ih后给予治疗组哇夏嘆1.5ml/100g ? d (含生药3g)灌胃，24h后继续给予1.5ml/100g/d，其余各组给予等量蒸饱水灌玲。

2.2.2模型使用线栓的制备方法
选取市售“贵花田”牌尼龙钓鱼线，直径约0.22?0.26mml36l，具体粗细应视动物具体体重大小而定，参照Ma等的制作方法并稍加改进，制备改良线栓。

具体方法为：首先把钓鱼线剪成50mm长短的小段备用，将约鱼线裁剪为50mm长的线段，头端靠近火焰后变成钝圆球状，去棱角使其光滑，用黑色记号笔分别在距头端10mm、20mrn处作一标记，以便在造模时观察到线栓头端位置和进入血管长度，用乙醇消毒，然后放置于肝素化生的理盐水里待用。.................

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第三章结果..........................................13

3.1各组大鼠神经功能受损评分和比较....................13

3.2 TTC染色结果......................................13

3.3 HE染色结果......................................14

3.4 TUNEL法检测凋亡细胞结果及各组件比较..............14

3.5大鼠血清MDA的测定及比较...........................15

3.6大鼠病灶K MMP-9检测结果及比较....................15

第四章讨论..........................................16

4.1自由基、MDA与脑缺血...............................16

4.2基质金属蛋白酶-9与脑缺血.........................18

4.3自由基和金属基质蛋白之间的相互作用...............22

4.4藏药哇夏嘎的神经保护作用.........................23

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结论

1.实验结果显示，藏药哇夏嘆对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能缺损有一定改善作用，可以减轻脑组织变性、细胞坏死等病理损伤，可以一定程度减轻脑水肿，并可缩小脑梗死的体积，抑制神经元洞亡。

2.本实验发现，藏药哇夏嘆降低大鼠脑缺血再灌注损伤后自由基的生成，减轻过氧化损伤，导致MDA的生成减少，并抑制缺血灶MMP-9的表达，保护血脑屏障，是该药发挥神经保护作用的可能机制。

探索开发藏医药，无疑是对民族医学潜力的挖掘与发扬，同时也为临床缺血性脑血管病的治疗提供了一条可能的新思路。目前我们对于哇夏嘆的研究，仅为初探其是否有脑保护功能，经实验发现，哇夏嘆确有一定的神经保护作用，其机制可能与降低自由基、下调MMP-9的表达有关，该药是否具有临床意义仍需要的大量的实验来验证，并存在众多问题需要进一步探讨。尽管如此，我们还应该注意到，祖国的民族医药库中有很多类似的药物等待我们利用现代的手段去开发和探索，有理由相信，一定会有越来越多的来自民族医学的药物将造福于临床脑血管病患者。

综上诉述，本实验的结果可以初步表明，藏药哇夏嘆可一定程度使大鼠脑I/R损伤后神经功能缺损症状改善，并且能够适当降低脑细胞水肿、坏死的病理损伤，进而使脑梗死体积有所缩小，减少自由基的生成，降低脑组织过氧化损伤，降低脑缺血再灌注损伤后血清MDA的生成，抑制梗死灶周围MMP-9的表达而保护血脑屏障，抑制神经调亡，发挥神经保护作用。

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