摘要 : 目的:观察人的腮腺唾液(PARS)、除腮腺外唾液(EPS)及纯化的高相对分子质量唾液粘蛋白(MG1)对变形链球菌Ingbritt、LM7、远缘链球菌OMZ-176的凝集作用。方法:采用分光光度计(酶标仪)测其A570值,测定唾液及MG1对变链菌和远缘链球菌的凝集力。结果:EPS介导的凝集力最高,MG1次之,PARS最低。第一代写网代写
关键词 : 唾液;粘蛋白类;变形链球菌;凝集
唾液粘蛋白(MG)是由人的颌下腺、舌下腺和小唾液腺的粘液腺泡细胞分泌,是蛋白质和糖的共价复合物。根据结构和生物学特性的差异,分为高相对分子质量唾液粘蛋白(high-molecular-weight salivarymucin,MG1)和低相对分子质量唾液粘蛋白(low-molecular-weight salivary mucin,MG2)。MG1的含糖高达78%,其众多的低聚糖结构与组织受体具有相似的结构,能被细菌识别而与之结合,导致细菌的凝集,使之失去附着至硬、软组织的能力,进而通过唾液流动的冲刷和吞咽被迅速排出口腔。变形链球菌是口腔中的主要致龋菌,其在牙面的附着定植是产酸致龋的先决条件,唾液中有多种成分能介导变链菌的凝集,从而使变链菌失去致龋作用。
许多学者从不同角度研究了唾液对变链菌的凝集作用,认为参与介导变链菌凝集的主要成分是富含唾液酸(sialic acid)的MG2,而MG1对变链的凝集作用低下。但将MG1从唾液中提取纯化,单独与变链菌作用的研究却未见报道。本研究先将MG1从唾液中提取纯化,再采用体外凝集实验方法,观察MG1、腮腺唾液(parotid saliva,PARS)和除腮腺外唾液(extraparotid saliva,EPS)对口腔变形链球菌Ingbritt(S. mutansIngbritt)、变形链球菌LM7(S. mutansLM7)和远缘链球菌OMZ-176(S.sobrinusOMZ-176)是否具有凝集作用,以探讨MG1及唾液对口腔变形链球菌的调控作用。
1 材料和方法
1.1 细菌培养
1.1.1 细菌及培养基 变形链球菌Ingbritt,变形链球菌LM7,远缘链球菌OMZ-176,由湖北医科大学口腔医学院实验中心提供,轻唾琼脂培养基(MSA,Def-co),牛心脑浸液培养基(BHI,Gibco)。1.1.2 培养 将变形链球菌Ingbritt、LM7和远缘链球菌OMZ-176接种于MSA平皿,37℃、φ为95%N2、φ为5% CO2培养48 h。挑取典型单菌于BHI培养基中,37℃、φ为95%N2、φ为5%CO2培养18 h。
1.1.3 细菌悬液的制备 将上述细菌离心,4℃,6 000 g, 10 min收集菌细胞,磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次,以PBS稀释并校正细菌悬液A700 nm=1, 4℃冰箱贮存待用。
1.2 MG1的提取采用徐燕[5]的方法并稍作改进。收集健康成人EPS,加入274.39 mmol/L十六烷基三甲基溴化铵(CETAB)沉淀MG1分子,羧甲基葡聚糖凝胶进行离子交换,上清对去离子水透析,冻干得MG1粗提物。Sephadex G-200凝胶层析得到纯化MG1。
1.3 唾液的收集和处理唾液标本由一无牙周疾患的健康成人志愿者提供。标本采集前2 h禁食,清水漱口, PARS收集采用Carlson-Crittenden装置;EPS收集使用Carlson-Crit-tenden装置将腮腺唾液引出口外弃去,同时口底置导管外接注射器抽吸;弃第1分钟收集液,收集的非刺激性唾液立即置冰浴试管中。4℃离心,4 000 g,15min,上清液置60℃恒温热浴10 min,使蛋白水解酶变性、灭活[3],加入终浓度为3.08 mmol/L叠氮钠抑菌。立即用于实验。
1.4 凝集实验实验分4组,分别MG1为1组,EPS为2组,PARS为3组,对照组PBS为4组。唾液或MG1(浓度为0.2 g/L)倍比系列稀释于PBS缓冲液中至32倍,唾液或MG1及其稀释液150μl加入96孔微效价板中,细菌悬液(A700=1)回温至37℃,超声仪处理1min以打开细菌链,每孔加入150μl。37℃孵育2 h。将200μl上清移入另一微效价板中,测A570,凝集的表达式采用Ligtenberg[6]的公式,即凝集率=[1-(A570标本/A570对照)]×100%。每个浓度为5孔,数值取其均值。
2 结 果
2.1 唾液、MG1对变链Igbritt的凝集倍比稀释的唾液及MG1与变链Igbritt的凝集实验。EPS可诱导Igbritt凝集,凝集率为32.8%。MG1也有一定的凝集率,可达25.68%。相比之下,PARS的凝集率明显低于上述各组,仅为13.52%。为了有效地检测凝集率,唾液及MG1稀释不超过26即32倍。
2.2 唾液、MG1对变链LM7的凝集唾液及MG1对变链LM7的凝集实验。EPS的凝集率为57.87%,MG1原液凝集率亦较高,达32.77%,并随着唾液稀释而缓慢下降。PARS初始的凝集率较低,为22.23%,并随着稀释迅速下调。
2.3 唾液、MG1对远缘链球菌OMZ-176唾液及MG1对远缘链球赛菌OMZ-176的凝集实验。EPS的凝集率较高,达35.46%,MG1凝集率为24.16%,相比之下,PARS凝集率只有16%左右。
3 讨 论
3.1 唾液及粘蛋白具有调节口腔微生物的作用 唾液在抵御毒素、病毒和病原体的非免疫性防御系统方面至关重要。进入口腔的生物迅速地被唾液封闭,大多数口腔细菌能在唾液中发生凝集。研究者认为这是细菌与多价唾液巨分子结合所致,粘蛋白即是一种具有此作用的唾液蛋白质。它们能与特定的口腔微生物选择性相互作用,并能与唾液中其它成分一起,从两个方面与微生物作用,一方面通过获得性膜中的实用口腔医学杂志(J Pract Stomatol)2003 Jan,19(1)粘蛋白对微生物粘附而有助于细菌在口腔表面定植;另一方面通过唾液中粘蛋白对细菌的凝集作用而有助于细菌的清除。
这些对立的力量相互作用调节着口腔微生物的数量和种类,决定了口腔的微生态。本研究结果表明,MG1对3种变链菌均具有一定的凝集作用,但作用低于EPS。EPS是由口腔中颌下腺、舌下腺和小唾液腺(唇腺、舌腺、腭腺和颊咽腺)所分泌,此唾液的主要成分是粘液唾液,粘蛋白(mucins,MG)含量很高,其中不仅富含MG1,也富含MG2。以往的研究较为一致地认为,由于MG2中唾液酸含量是20.3%(重量), MG1的唾液酸含量为4.0%(重量),故MG2可提高依赖唾液酸的对变链菌的凝集率,这可能是EPS的凝集率大于MG1的原因。
3.2 凝集的生物学机制研究表明,口腔细菌能以高度特异方式与MG起作用,MG致细菌凝集的机制有多种[1]:如唾液粘蛋白的重要组成—唾液酸,常是微生物识别并与之结合的部位。唾液酸作为受体(receptors),链球菌表面植物血凝集样分子为附着素(adhesins),受体和附着素的互补性分子以立体化学方式发生作用而致凝集。在本研究中,对变链菌Ingbritt和LM7,EPS的凝集率高于MG1,这是由于EPS中不仅富含MG1,同时也含有MG2,提示此凝集主要依赖于唾液酸。但对于远缘链球菌OMZ-176,MG1和EPS均具有相似的凝集率,提示唾液酸不是唯一的受体。
MG1分子上大量不同的碳水化合物侧链是微生物广泛的粘附部位,能被细菌识别、诱使细菌与之结合。如半乳糖胺亦是MG1的重要组成,此糖基也是细菌识别粘附的受体。Ramphal[7]研究认为绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)可识别此糖基并与之结合而致凝集。MG还能与唾液中其它大分子物质结合,如与唾液IgA结合形成复合物,作用于口腔细菌使之凝集成丛。此外,MG1分子中的蛋白结构亦可被细菌识别而结合,如Veerman研究认为副流感嗜血菌(Hemophilus parainfluenaze)表面的蛋白质附着能识别MG的无膜区域(非糖基化)的聚肽而致其附着凝集。Koop[9]认为是MG的一些理化属性可导致细菌的凝集。
3.3 凝集作用依赖唾液或MG1的浓度非刺激性全唾液中蛋白质含量为1.3 g/L,MG1的平均含量为0.2 g/L[10]。故本研究中MG1的原始浓度采用0.2 g/L。将唾液原液与MG1原始浓度采用倍比稀释至32倍,结果可见,随着唾液逐渐稀释,对细菌的凝集率逐渐下降。为了保证凝集的效价,稀释控制在32倍之内,可见唾液及MG1对变链菌的凝集是依赖其浓度的。
参考文献
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