1文献综述
1.1引言
随着人类平均寿命的延长和人类生活环境中多种致癌因素（汽车尾气，工业污染等）的不断增加，肿瘤已经成为当前危害人类健康的主要疾病之一，同心脑血管病一起被称为三大死神，是医学领域最难攻克的疾病之一。据世界卫生组织调査发现，目前全世界每年有1000万人罹患恶性肿瘤，其中600多万人死亡；2008年，据卫生部统计表明，肿瘤位居我国城市和农村的死亡首位，我国已经成为世界第二大癌症高发国。因此，研究有效的抗癌药物成为全球科研机构和制药企业的重中之重；通过国家不断科研基金的投入和科研工作者的不断努力，一些抗癌药物也已经上市或者进入临床研究。
长期以来，临床所使用的抗癌药物基本是以DNA分子为药物靶点、以杀死肿瘤细胞为目标的化疗药物。药物分子通过抑制DNA的合成，或者作用于DNA双螺旋表面的沟槽等方式干扰转录和复制，来千扰或者阻断细胞增殖的过程。但是，这种以DNA作为药物靶点的抗癌药物，在杀死癌细胞的同时不可避免地对正常的细胞和组织造成很大的伤害。虽然这些药物都具一定的治疗效果，但是基于这种机制的化疗药物在临床应用上存在毒副作用大和易产生耐药等缺点。发现和研究新的作用机制的肿瘤药物成为研究的热点。
近年来，随着肿瘤学和分子药理学的发展，抗肿瘤药物的研究和开发进入一个新的时代。科研工作者通过寻找抗肿瘤药物作用的特异性靶点，发现以蛋白类凋亡因子作为药物靶点及合成以诱导凋亡为机制的新的抗肿瘤药物具有机理明确、副作用少的优点，逐渐成为研究机构和FDA的新宠。研究表明，肿瘤的发生和凋亡机制的紊乱有关；细胞凋亡是一种保守的细胞程序性死亡的过程，是多细胞个体移维持机体正常代谢平衡的机制；TF常细胞凋亡是一个主动的过程，受到基因、蛋白等多重因子的精确调控，而癌细胞由于机制紊乱逃避了这个过程。细胞凋亡在生物体发育形成及功能维持中起着重要作用，以诱导肿瘤细胞凋亡的方式代替杀死肿瘤细胞的治疗药物，显示出低毒或无副作用的强大优势，因而已成为当今抗癌药领域的的-沿研究热点。通过设计合理药物分子，模拟细胞凋亡过程中的天然配体的结构和作用机制，在不伤害正常细胞的情况下去拮抗不正常的蛋白因子，从而诱导细胞凋亡成为指导思想。
1.2细胞凋亡和Be 家族蛋白
细胞凋亡（Apoptosis)即程序性细胞死亡。多细胞的生物机体通过细胞凋亡机制清除多余或有害细胞，使机体处于个良性的动态平衡过程中。细胞凋亡具有高度保守的特点，相似的细胞凋亡的分子机制存在于不同种属的生物体内。细胞发生凋亡的过程涉及Caspase激酶的级联反应，逐歩放大凋亡信号，最终导致特征性的形态学变化，括细胞膜皱缩，细胞核染色质的质密化，细胞凋亡小体的形成等。细胞调亡是机体正常存在的一个生理过程，凋亡的异常发生会导致肿瘤、退行性疾病等疾病的发生。这些疾病的发生与凋亡的信号通路扰乱及凋亡参与因子（Bd-2蛋白家族，死亡受体等）胞内表达水平的异常等原因密不可分。
研究表叨，细胞调亡通路包括内源和外源两条力}通路。内源通路乂被称为&粒体.凋亡通路，死亡受休介导的凋r:通路则);4于外源通路。线粒体凋r:通路的顶点Bcl-2家族蛋白。凋亡信号的刺激，直接或接的激活Bcl-2促凋亡蛋ri(Bax、 Bak等)，促使Bax和Bak插入线粒体胶并且形成源或者昇源的多聚休，引起线粒休脱迎透性的改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素。释放的细胞素C与凋亡促进W f Apaf-1结合引起Apaf-1多聚，进而激'；,Caspase-9，Caspase-9激活Caspase-3，使細胞lit入不可逆的凋亡过程。另一条途径称为死亡受体途：死亡受休（ Tumor necrosisfactor receptor, TNFR) 胞外的死亡配体（Tumor necrosis factor, TNF)结合后激；该途径。受体激活后进而进行多聚化及好^衔接itil'l,然后导致Caspase 8激活，动Caspase级联反应，liS终激活Caspase 3,降解胞内结构骨架和能細胞。内源和外源两条凋亡途径并非孤立存，它们之I'Hj存在若交义通路：死r:受休通路涉及到Bid蛋白的分解，产生了有活性的tBid， tBid可以作为一个直接激活因子参与Bax和Bak的激活，从而启动线粒体凋亡通路。
1.3 Mcl-l蛋白的结构和功能
Mcl-l蛋白是Bcl-2家族蛋要的抗调亡，研究发现细胞内过农达的Mcl-l蛋白会导致多发性髓瘤、急性粒细胞性血痛3恶性肿。通过干扰技术或者靶向小分子药物下调McM蛋白， 以促使这些肿瘤-细胞走向。
由于受细胞内泛素-蛋白酶体的降解作用，Mcl的半衰期仅有2~4个小吋。因此Md-1可能通过更加复杂的作用机制发挥诱导凋亡的作用。例如它自身的表达水平会直接决定细胞的凋亡与否，而它和Bcl-2家族其它成员的相互作用又决定了它的水平：McI-1/Bim的相互作用可以稳定胞内Mcl-l蛋白的浓度水平，防止了 Mcl-l蛋白进入泛素化修饰后的降解途径，但是Md-1与Noxa的相互作用后，此二聚体容易进入降解的过程。
Mcl-l与Bcl-2之间存在着代偿作用。最新的研究发现，Mcl-l能够作为一个缓冲站，将己经被激活的Bax/Bak和部分BH3-only蛋白"稀释"，从而抑制凋亡；还有研究发现，Bcl-2蛋白受到小分子抑制剂的拮抗，细胞内会发生Md-1水平的动态上调。这种小分子胁迫导致的细胞内Mcl-l蛋白水平上调，在凋亡诱导配体TRAIL的研究中也被发现。
2Mcl-1蛋白的表达纯化及结构性质鉴定…………19
2.1引言…………19
2.2实验材料与试剂……………20
2.3实验方法…………..21
2.3.1重组Md-1蛋白的^因克隆……………21
2.3.2感受态细胞的制备及转化……………24
2.3.3 Mcl-1蛋白的原核表达纯化…………25
2.3.4聚丙烯酰胺凝胶I乜泳和western blot分析……………27
2.3.5 Mcl-1蛋白的岡二色ill测定………………28
2.3.6 15N feid Mcl-1蛋白核磁图iff测……………29
2.4结$和讨论…………..30
2.4.1重组基因的克隆结果分析………30
2.4.2 Mcl-1蛋白的表达it分析…………31
2.4.3 Mcl-1蛋白的分离纯化流程………36
2.4.4纯化的Mcl-蛋白的结构性质分析…………38
3小分子抑制剂与Mcl-1蛋白结合模式的HSQC研究……42
3.1引言……………42
3.2实验部分…………42
3.2.1荧光偏振试验（FP) …………42
3.2.2等温滴定量热（ITC)…………43
3.2.3分子对接实验………….44
3.2.4 HSQC滴定实验………45
3.3结果分析…………45
3.4本章小结……………57
结论…………59
参考文献…………60
结 论
1.构建了用于表达Md-1蛋白的重组质粒，通过优化细菌表达培养的条件，采用选择宿主和培养基转接的方式，分别提高了未标记和l5N标I己的Mcl-1蛋白在不同培养基中的表达量。利用BLR宿主，未标记Mcl-1蛋白在LB培养基中的表达量提高到8mg/L培养液；通过转接培养，15N标记的Mcl-1蛋白在M9培养基中的表达量提高到7.2mg/L培养液。
2.利用亲和层析和分子筛层析两步层析方法，获得了电泳纯的Mcl-1蛋白；通过圆二色谱的测定，初歩分析了纯化后的Mcl-1蛋白二级结构，是一个以a螺旋为主的蛋白。接着，对l5N标i己的Mcl-1蛋白进行一维谱和二维图谱的测定，NMR实验说明表达纯化的Mcl-1蛋白l5N标记均匀，Mcl-1蛋白在空间结构上折叠良好，所有氨基酸的二维共振峰适度分散，可以进行后续基于NMR的药物筛选分析。
3.通过二维核磁HSQC滴定实验，分析小分子S1对Mcl-1蛋白HSQC图谱的影响。研究表明，S1分子引起了 Mcl-1蛋白的疏水沟槽上的氨基酸有着较大化学位移，说明S1确实结合到Md-1蛋白的BH3沟槽上；深入分析发现，蛋白HSQC图谱上M231，V253等氨基酸化学位移大于0.05ppm，精确的说明了我们的小分子S1结合到Mcl-1蛋白的P2和P3 口袋上。基于核磁条件约束分子对接，发现S1分子的硫代吗啉环占据了Mcl-1蛋白的P2 口袋，S1分子的羰基与Mcl-1蛋白R263残基形成了氢键；核磁条件约朿分子对接的结果明确了 S1分子与Mcl-1蛋白的结合模式。
4.基于S1分子与Md-1蛋白的结合模式，指导并合成了一系列的衍生物如H2分子；通过核磁滴定发现，H2分子能够引起Mcl-1蛋白P2， P3， P4 口袋上的氨基酸有着显著的化学位移；H2分子在保持占据Mcl-1蛋白P2 口袋的同时，通过延伸的苯丙氨基占据了 P4 口袋。结合分子对接的结果可知，经过修饰和改造S1分子的两个取代位点后，获得的衍生物H2更好的适应Mcl-1蛋白的疏水沟槽。利用NMR技术分析Mcl-1蛋白抑制剂的构效关系，明确S1及其衍生物对蛋白的结合状态及模式，可以为后续的小分子的设计研究提供指导和为机制研究提供结构基础。
5.基于S1分子与Mcl-1蛋白的结合模式，利用基于片段药物设计方式得到了特异的Mcl-1蛋白抑制剂4g;通过核磁滴定和分子对接的结果说明，48分子能够以很稳定的构象占据了 Mcl-1蛋白的P2， P3 口袋。深入分析发现，图谱上V216， V220等P4 口袋的氨基酸化学位移均大于0.05ppm， 4g分子充分模拟了 Noxa保守的亮氨酸和苯丙氨酸等残基的占据Mcl-1蛋白疏水口袋，以稳定的构象拮抗Mcl-1蛋白，为后续深入研究提供了指导。
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