前言
宫颈癌是全世界妇女中最常见的恶性肿瘤之一（仅次于乳腺癌的第二位常见恶性肿瘤），在我国一直高居妇科恶性肿瘤的首位。各国妇女宫颈癌的发病率均随年龄增长而上升，40岁以后发病率显著增加。近来宫颈癌发病率升高且呈低龄化趋势。因此对宫颈癌病因、发病机制的研究，以及寻求更敏感的宫颈癌早期诊断、更有效的治疗方法就显得尤为迫切。细胞间连接是维持和调控组织结构稳定的基本条件，对细胞的增殖、分化有重要影响。细胞间连接主要有紧密连接（tight junctions，TJs），黏附连接（adherensjunctions，AJs）和缝隙连接（gap junctions，GJs）。TJs是由跨膜蛋白（occludin，claudins蛋白）与膜蛋白（如ZO-1，ZO-2，ZO-3和JAM）连接到细胞内骨架蛋白（如actin）等所组成的复杂的复合物结构。TJs位于上皮细胞或内皮细胞的连接复合体中，在细胞之间连续排列成吻合脊，构成网状结构将相邻细胞膜紧紧地连接在一起，从而有效地封闭了细胞间隙。
Occludin又称闭锁蛋白，是TJs结构中第一个被发现的，也是第一个被分离出来的组成紧密连接的完整跨膜蛋白。人Occludin是由522个氨基酸残基组成的一条多肽链，其mRNA全长2379bp，基因定位于人类染色体5q13.1。Occludin是目前了解最为清楚的跨膜蛋白，是TJs的主要功能调节蛋白，也被认为是TJs结构中最敏感和最可靠的标志。Occludin基因在进化上很保守，小鼠、人、狗该基因有90%的同源性，其生物学功能与细胞间黏附、移动和细胞间通透性调节密切相关。
正常分化组织的细胞组成是高度有序的，癌组织则通常缺乏这种特性，常表现为异常的TJs。癌细胞之间黏附性降低，不但使其具有局部侵袭性，而且使肿瘤细胞能够离开原发部位通过血管和/或淋巴管向远处转移。在分化良好的来自上皮或内皮的腺癌上有相当数量的occludin，而去分化癌细胞TJs结构破坏，TJs的栅栏作用失调及细胞极性丢失，细胞脱离正常生长、分化和组织构建的控制，导致接触抑制的丢失及细胞间的信号传导通路的失调，形成了典型的早期细胞极性丢失和生长失控。Occludin作为紧密连接的重要跨膜蛋白可能在细胞解离过程（肿瘤侵袭转移的第一阶段）中起重要作用。
目前认为，肿瘤组织中的occludin表达随恶性度增加而减少。在子宫内膜癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、皮肤角化鳞状细胞癌等肿瘤中随着肿瘤恶性程度的增加，occludin的表达相应减少。Osanai等人用occludin基因进行体内实验，结果发现，对肿瘤侵袭及转移均有抑制作用。Tobioka等用抗occludin的单克隆抗体半定量分析人类子宫内膜癌的组织切片中发现，occludin的表达随着肿瘤分期的上升而下降，并且下降的occludin表达与子宫肌层浸润和淋巴结转移相关。研究证实：疾病状态下，包括炎症和肿瘤都可以使occludin的表达显著下调。
在宫颈上皮内瘤变（CIN）、原位癌（CIS）、尤因肉瘤∕原发性神经外胚层瘤中几乎全部病例、甲状腺癌中的乳头状微癌，髓样癌，低分化癌、胆道癌、侵袭的乳腺癌细胞株中occludin的表达强度是减少的。Li等人通过对鼠唾液腺上皮细胞株（Pa-4）的研究发现，occludin控制细胞表型的改变，与上皮性肿瘤形成相关。由于occludin的减少，TJs结构遭到破坏，进而导致细胞完整性破坏，细胞间隙增大，细胞间的黏附作用减弱，为癌细胞的侵袭、脱落和转移创造了前提条件。顺铂（cisplatin，DDP）作为治疗肿瘤的一线化疗药物，具有抗瘤谱广和对乏氧肿瘤细胞有效的特点，对于宫颈癌的疗效是肯定的。但该药在作用于肿瘤的同时还会引起骨髓抑制和耳毒性等不良反应，大剂量或连续用药可致严重而持久的肾毒性，所以降低其毒副作用意义重大。近年来，中医药防治肿瘤的作用机制正逐渐被现代医学研究所揭示，研究发现一些中药有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，因此将化疗药和中药结合起来应用于肿瘤的治疗，已引起众多学者的关注。
苦参碱（matrine，Mat）是豆科槐属植物苦豆子的主要生物碱，其作为一种传统的中药成分在抗炎、抗心律失常、抗过敏、平喘、镇痛和抗病毒方面有很大的影响。近年来研究发现其有抗肿瘤作用，作用呈剂量﹑时间依赖性，小剂量可抑制细胞增殖与诱导细胞分化，大剂量可促进细胞凋亡，甚至导致细胞坏死。川穹嗪（tetramethylpyrazine，TMP），为中药川穹的主要有效成分，化学结构为2，3，5，6-四甲基吡嗪，是自伞形科蒿本属植物川芎根茎中分离提纯的一种中药活性生物碱。其主要作用有增强心肌收缩力；扩张血管、降血压作用；扩张冠状动脉，增加冠脉流量抗心肌缺血；抗脑缺血；抗氧化作用；抑制血小板聚集﹑抗血栓形成；镇静﹑镇痛；舒张平滑肌的作用等多种药理作用[。近年研究发现，TMP既可直接抑制肿瘤细胞的生长，还具有抗肿瘤转移、增强化疗药物疗效﹑逆转多耐药﹑减毒和细胞保护等生物学效应。
但国内外尚未见occludin在人宫颈癌组织中的表达及与宫颈癌发生发展和预后关系的报道，也未见有关顺铂联合苦参碱和顺铂联合川穹嗪对宫颈癌Hela细胞抑制作用以及顺铂、苦参碱、川穹嗪、顺铂联合苦参碱和顺铂联合川穹嗪分别作用于宫颈癌Hela细胞前后对occludin表达影响的研究报道。
本研究分两部分：第一部分（组织部分）从RNA和蛋白质两个水平层次的检测，结合临床资料，探讨紧密连接蛋白occludin的表达与人宫颈癌发生发展和预后的关系，为宫颈癌的诊断和预后判断提供理论依据和新检验指标；第二部分（细胞部分）通过研究顺铂、苦参碱、川穹嗪、顺铂联合苦参碱和顺铂联合川穹嗪对人宫颈癌Hela细胞增殖的作用以及上述药物作用于Hela细胞前后occludin mRNA和occludin蛋白的表达变化，探讨上述药物对Hela细胞增殖的影响及其与紧密连接蛋白occludin表达水平的关系，为临床治疗宫颈癌开辟新的途径提供基础实验依据。
2．第一部分
2.1材料与仪器………………..8
2.2实验方法……………10
2.3结果•……………16
2.4讨论……………23
2.5结论……………25
3．第二部分
3.1材料与仪器……………26
3.2实验方法……………28
3.3结果……………31
3.4讨论……………41
4结论……………43
参考文献……………44
综述……………52
4结论
1.顺铂、苦参碱、川穹嗪、顺铂联合苦参碱和顺铂联合川穹嗪均具有抑制人宫颈癌Hela细胞增殖的作用，其抗增殖的效应呈时间和剂量依赖性。
2.苦参碱和川穹嗪分别与顺铂联合作用对宫颈癌Hela细胞的抑制作用明显增强，提示这两种药物分别与DDP联合应用具有协同抗肿瘤效应。
3.上调细胞occludin表达水平是顺铂、苦参碱、川穹嗪、顺铂联合苦参碱和顺铂联合川穹嗪抗宫颈癌的作用机制之一。
参考文献
[1]刘会玲,杨毓琴,糜若然,等.不同剂量紫杉醇联合顺铂新辅助化疗在宫颈癌的应用[J].实用妇产科杂志,2008,24(6):350-352.
[2]国务院防治艾滋病工作委员会办公室,联合国艾滋病中国专题组.中国艾滋病防治联合评估报告.2011,12.
[3]姜晓梅，吕繁.暴露前药物预防：预防HIV感染的潜在新策略.疾病控制杂志，2008， 12(2)： 159-163.
[4]刘庆彤,师水生.过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其配体与肝纤维化研究进展.国际消化病杂志,2007,27(2):137-139
[5]骆抗先.乙型肝炎基础和临床[M].北京:人民卫生出版社,1997:370-386
[6]Huber D,Balda MS,Matter K.Occludin modulates transepithelial migrationof neutrophils[J].J Biol Chem,2000,275(8):5773-5778.
[7]Itoh M,Bissell MJ.The organization of tight junction in epithelia http://www.1daixie.com/dxyxlw/:implicationsfor mammary gland biology and breast tumorigenesis[J].J Mammary GlandBiol Neoplasia,2003,8(4):449-462.
[8]Tobioka H,Isomura H,Kokai Y,et al.Occludin expression decreases with theprogression of human endometrial cacinoma[J].Hum Pathol,2004,35(2):159-164.
[9]Busch C,Hanssen TA,Wagener C,et al.Down-regulation of CEACAM1 inhuman prostate cancer:correlation with loss of cell polarity,increasedproliferation rate,and Gleason Grade 3 to 4 transition[J].Hum Pathol,2002,33(3):290-298.
[10]Yin F,Qiao T,Shi Y,et al.In situ hybridization of tight junction moleculeoccludin mRNA in gastric cancer[J].Zhonghua zhong Liu Za Zhi,2002,24(6):557-560.