1 前言
1.1食品安全现状
近20几年来，随着全球经济一体化和食品贸易国际化的发展，我国社会经济和生活水平的提高，食品安全己成为世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。植物源和动物源食品安全是全世界关注的焦点，而农药和兽药残留问题是影响食品安全的主要因素之一。动物源性食品中兽药残留现象时有发生，例如出口法国的蜂蜜由于“杀虫脒”残留超标而被退货；1990年出口日本的肉鸡，检测出氯羟吡啶的残留量超标；1998年从内地出口到香港的生猪，因含违禁药物“瘦肉精”而导致17人中毒；2002年浙江省杭州、嘉兴、金华等地相继发生的“瘦肉精”中毒事件。此外，我国出口到美国、日本和欧盟等国家的肉类、蜂蜜、鱼虾等农产品因出现药物残留超标问题，被进口国拒收、扣留、索赔、退货的事件时有发生。因此，建立简便、快捷的检测方法以监控食品中的药物残留是一项迫在眉睫的食品安全工作。
1.2兽药残留
兽药残留是“兽药在动物源食品中的残留”的简称，它是指动物在使用药物预防或治疗疾病后，药物的原形或其代谢产物可能蓄积、储存在动物的细胞、组织、器官或可食性产品中。有的药物以游离的形式残留于器官和组织，也有部分药物以结合形式存留于组织，这种与组织蛋白结合的残留可能时间更长。广义上的兽药残留除了由于防治疾病用药引起外，也可由于使用促生长饲料添加剂、动物接触或吃入环境中的污染物，如农药、重金属、霉菌毒素等引起。目前，兽药残留可分为7类：抗生素类；驱肠虫药类；生长促进剂类；抗原虫药类；灭锥虫药类；镇静剂类；（3-肾上腺素能受体阻断剂)。
阿维菌素类药物(Avermectins, AVMs)是由放线菌产生的一组新型、广谱的大环内酷类抗生素，主要有阿维菌素（Avermectin, AVM)、伊维菌素(Ivermectin，IVM)、多拉菌素(Doramectin, DOR)和埃普里诺菌素(Eprinomectin，EPR)。
1975年，在日本北里研究所首先分离到产阿维菌素的链霉菌；1976年,美国Merck公司从该菌发酵菌丝中提取出一组由8个结构相近同系物组成的混合天然产物，并命名为阿维菌素。在美国和加拿大等国家，AVM自发现伊始就广泛应用农作物和园艺作物，用于昆虫和螨虫的防治。20世纪80年代末，我国开始引进阿维菌素菌种，并在1993年原北京农业大学微生物工程工业试验基地首次成功研制出AVM。由于AVMs化学结构新颖、作用机制独特，有较高的安全性和优良的驱虫活性，因此被认为是目前最优秀、销量最大、应用最广泛的一类新型、高效、广谱、安全和用量小的抗体内、外寄生虫药物，是近20年来抗寄生虫药物研究中最为杰出的研究成果，其中AVM及IVM已广泛应用于食品动物及水产动物的寄生虫病防治。虽然AVMs药物有其独特的优点，但按世界卫生组织(WHO)五级分类标准，AVMs仍属高毒化合物，在动物体内残效时期长。当今国内外对食品安全越来越重视，几乎每个国家对食品中兽药残留都有相关的残留限量规定。随着我国社会经济的发展和生活水平的提高，食品安全问题引起了全社会的广泛关注，特别是加入WTO后，对畜禽及水产品的质量要求越来越严格。因此，动物性食品中AVMs的残留己受到国内外极大关注。
2材料与方法...........19
2.1实验材料...........19
2.2实验方法............21
3结果与讨论............29
4结论..........48
5展望..........49
6参考文献........50
4结论
本论文将阿维菌素进行化学结构改造，得到半抗原4-0-SUCCinoylAVM。利用活化酯法将阿维菌素半抗原与BSA偶联制备免疫抗原，采用NHS法将阿维菌素半抗原与OVA偶联制备包被原，并最终得到阿维菌素多克隆抗体。采用间接竞争酶联免疫方法测定抗血清效价值为1: 20000，该抗体对阿维菌素具有较高的特异性。在此基础上选择了阿维菌素类药物，伊维菌素、埃普里诺菌素进行抗体结合反应。实验结果表明该抗体可以识别阿维菌素类药物。
研究建立了阿维菌素类药物间接竞争酶联免疫检测方法，确定了检测中关键的包被原的包被量0.5 ^ig/well,抗体稀释度1: 5000，标样的稀释液为含10%甲醇的PBS溶液，pH为7.4，绘出阿维菌素类药物间接竞争ELISA标准曲线。阿维菌素从100 ng/mL采取 4 倍梯度稀释，阿维菌素 IC50=1.92 ±0.3 ng/mL, IC15 = 0.13 ± 0.03 ng/mL;伊维菌素从200 ng/mL采取4倍梯度稀释，伊维菌素IC50 = 8.75± 0.5 ng/mL, IC丨5 = 0.55 土0.05 ng/mL；埃普里诺菌素从100 ng/mL采取4倍梯度稀释，埃普里诺菌素IC5o= 1.56±0.3 ng/mL, IC15 —0.10 土 0.02 ng/mL。
由于阿维菌素类药物是农兽两用药，所以选取牛肉、猪肉、猪肝、梨作为主要检测样品考察他们的基质影响及去除方法，样品处理方法简单，回收率平均75.20%-89.78%,能满足实际样品的检测需要。以高效液相色谱检测方法为标准，对建立的阿维菌素间接竞争ELISA检测方法的准确性进行验证，线性相关系数R2值为0.9862，结果充分说明了本实验建立的阿维菌素间接竞争ELISA分析方法是一种高效、快速、简便的检测方法。
对本研究建立的间接竞争ELISA的稳定性进行了研究。通过稳定性实验，确定了抗体和包被原的保质期限，为进一步研发阿维菌素多残留试剂盒奠定基础。
参考文献
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