1 前言
自进入工业社会以来，经济迅速发展，人们物质生活水平R益提高，生活质量明显改善，但也造成了营养成分摄入不均衡。其中，高糖、高蛋白和高脂肪食物在人们营养摄入中所占比例越来越高，导致高血压、高血脂、冠心病、心肌梗塞、脑梗塞等疾病成为人类健康的巨大威胁。目前，心血管疾病，尤其是血栓栓塞性疾病是危害人类健康的一大杀手，血栓栓塞性疾病主要有3种：（1)冠状动脉疾病形成血栓，主要指急性心肌梗死（AMI) ; (2)脑血管疾病形成血栓，即脑血栓中风；（3)末梢动脉疾病形成血栓，即脉管栓塞。这其中，急性心肌梗死是造成死亡的原因。根据统计，在美国每年大约有900,000人患有AMI，其中死亡人数达225,000人，由于发病到死亡的时间特别快，有大约125,000人在未来得及治疗时便已经死亡。在我国，据统计每年有300万人需要溶栓药物治疗。DeWood等研究发现，大多数的急性心肌梗死是由冠状动脉的闭合栓塞引起血流不足及心肌死亡而导致的。
溶栓治疗是血栓性疾病安全而有效的治疗手段，因此研制发展高效、特异、安全、副作用小的溶血栓药物，一直是世界范围的热门课题。早在二十世纪七十年代就已经发现复发性深部静脉栓塞的患者的组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogenactivator,tPA)含量很低。80年代以来，国际多个大型临床实验证实，溶检治疗可以降低AMI病死率30%以上。溶栓药物可以通过溶解血栓、增加心肌血流、改善供氧使梗死范围缩小；通过防止血管再阻塞或减少心肌氧耗预防再梗死；通过降低心脏负荷、改善缺血损伤区的供血预防梗死范围扩展及心室重构，从而使AMI的临床治疗得到很大幅度的提高。
最早发现并使用的链激酶和尿激酶属第一代溶栓剂其主要不良反应为引起机体大量出血，尤其是颇内出血的危险性大。它是一种细菌蛋白，重复使用易引起过敏，重者导致病人死亡。第二代溶栓剂主要包括甲氧苯甲酷纤酶原链激酶复合物(Anisoylated plasminogen strep to kinase activator complex, APSAC)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（ chain urokinase plasminogenogen activator，scu-PA)、组织型纤溶酶原激活剂（tPA) 。tPA与第一代溶栓药相比存在很多优点，首先是它的溶栓能力特别强。其次是第一代溶栓药有一个共同缺点，即注射这类药物后毛细血管出血往往不易停止。因此凡有中风危险的人或刚动过手术的病人都不能使用第一代溶栓药物。而tPA不但没有上述缺点，也没有链激酶那样的药敏作用，故它的使用范围远比第一代溶栓药物要广泛。tPA是第1个基因工程重组的溶栓药物，能够激活纤溶酵原转变为纤溶酶，溶解血栓中的纤维蛋白，发挥高效特异的溶栓作用，国内外已用于临床治疗血栓。1987年美国FDA批准组织型纤溶酶原激活剂（tPA)作为治疗急性心肌梗塞的基因工程药物投放市场，1990年FDA又批准其用于治疗急性肺检塞。
2材料与方法......17
2.1 材料.........17
2.2方法............21
3 结果与讨论.........29
4结论.............45
5展望..............46
参考文献...........47
4结论
组织型纤溶酶原激活剂突变体(rPA)具有在血栓局部高效特异性溶栓作用。但从天然材料中很难大量制备rPA，用于治疗甚至研究。通过基因工程手段获取大量rPA是一条很有希望的途径。在本研究中，我们利用大肠杆菌表达系统，以融合蛋白形式.表达获得了具有正确溶栓生物活性的重组rPA，取得了较为理想的实验结果：
1.以重组质粒pMD18t-tPA为模板，利用设计的特异引物1和引物2，通过PCR反应扩增了 rPAcDNA。
2.将PCR产物与pET-40b连接构建了重组质粒pET-40b-rPA，并转化入Rcoli DH5a感受态细胞中，筛选出阳性菌落，并进一步釆用琼脂糖凝胶电泳、双酶切及序列测定等方法对重组质粒进行了鉴定结果表明克隆到的l.lkb基因片段，与文献报道的rPA序列完全一致，同时与上游DsbC蛋白具有正确的读码框，表明DsbC-rPA融和蛋白原核表达质粒构建成功。
3.优化确定了 IPTG与乳糖诱导表达条件，选择乳糖诱导的最佳条件(诱导终浓度为3 g/L,诱导温度为30。C,诱导时间为5 h)与本研究前期优化确定的IPTG最佳诱导条件（浓度为0.6mmol/L，温度为25。C，时间为3 h)对收获的生物量和目的蛋白表达量进行比较，结果表明，二者均可诱导获得DsbC-rPA以可溶性形式表达，目的融合蛋白占菌体总蛋白含量分别可高达40%,其中以乳糖为诱导剂菌株生长略优于以IPTG为诱导剂，同时考虑成本因素，确定以乳糖作为诱导剂。
4.利用融合蛋白上的His-Tag标签，利用镍柱法对融合蛋白进行纯化。结果表明，融合蛋白DsbC-rPA可以用含10 mM咪唑缓冲液从镍柱上洗脱下来，纯化后蛋白的纯度高达90%。
5.融合蛋白用镍柱法纯化后，利用Xa因子对融合蛋白进行切割，SDS-PAGE分析结果显示可释放获得正确的rPA目的蛋白。
6.利用纤维蛋白平板法进行活性检测’结果表明所得到的重组rPA产物能够体现出正确的溶栓活性。
综上所述，本实验将rPA与二硫键异构酶DsbC融合后在大肠杆菌中进行表达，在乳糖诱导下获得了可溶性的DsbC-rPA融合蛋白，融合蛋白经亲和纯化、Xa因子切割后，可获得具有正确溶栓活性的重组rPA蛋白，为建立高产率、低成本的rPA大肠杆菌表达生产体系奠定了基础。
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