前言
伴随经济的高速发展，人民生活水平不断提高，饮食结构发生了较大的改变，但膳食营养结构的不合理也导致包括高血脂、肥胖、高血压、动脉硬化、糖尿病及恶性肿瘤等疾病的发病率逐年上升，成为现阶段和今后很长时期危害人们身体健康的主要疾病谱。改变不良的饮食生活方式和合理的药物治疗是预防和缓解上述疾病进展的有效措施。尽管上述疾病的发病机制错综复杂，但总体上系遗传和环境因素共同作用下的结果。随着分子生物学研究的不断深入，研究发现，上述疾病的发生与发展均与细胞内过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisomeproliferatoraetivatedrecePtors，pPARs)有密切关联。ppARs由Issemannl和oreens于1990年首次发现并报道，是一类由配体激活的核转录因子，属n型核激素受体超家族成员，包括PPARa、侧6、y三种受体亚型。在没有PPARS配体的情况下，细胞内的PPARs与维甲类x受体a(RXRa)形成异二聚体PPARs爪XRa，并招募共抑制蛋白复合体以抑制靶基因的表达;当PPARs配体与之结合时，共抑制分子就会脱离PPARS/RXRa异二聚体，并募集多种共激活因子到所调节基因的启动子上游区域并由此启动靶基因的转录。PPARs转录启动特点是在各种共刺激因子的帮助下与启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件 (Peroxisome ProliferatorresPonseelement，PPRE)结合，从而发挥对靶基因的转录调控作用，并由此实现其诸多不同的生物学效应。以上各环节分子的有序相互作用，形成了PPARs信号通路发挥作用的完整的分子作用链。
现有的研究表明，不同亚型的PPARS具有不同的组织细胞分布特点，可能与其功能作用上的差异有关。PPAR丫在脂肪组织中高表达，而在肝脏和骨骼肌中表达很低。其功能复杂多样，包括调节脂肪和糖代谢，诱导肿瘤细胞分化或凋亡，抑制肿瘤的转移及血管生成，抑制炎症反应，抗肝纤维化作用，抗动脉粥样硬化，改善心功能，保护肾脏，降血脂和降血压，神经保护等。ppARa主要分布在脂肪酸代谢旺盛的组织，如肝、肾、心脏、肌肉、棕色脂肪组织、小肠和大肠，在调节脂类代谢及炎症反应中发挥重要作用。PPARp/6分布广泛，在皮肤、骨骼肌、脂肪组织、炎症细胞、心脏及各种肿瘤中均有表达。近来研究表明，激活PPAR侧6有望成为治疗代谢综合征及其相关的心血管疾病的新途径。
基于PPARs所具有的调节物质代谢和细胞增殖分化等的生物学作用，使得筛选出具有激动PPARs的天然配体和人工合成具有激活PPARS的有效化合物成为生物医药领域研究的热点。围绕这一领域的研究，有望寻找到治疗代谢综合征和肿瘤新的有效药物，其理论意义和应用前景明显。本研究采用细胞作为生物载体，以人工模拟PPARs信号通路作为理论思路，在此前构建的含人PPARs高效真核细胞表达载体的基础上，将含有PPARS受体的完整基因序列的真核表达载体和含人PPRE报告质粒共转染293T细胞，经阳性药物干预后，采用双荧光素酶报告基因检测系统进行相应的量一效、时一效关系检测分析，并对建立的药物筛选平台的特异性和应用能力进行鉴定，获得了理想的实验结果。这为今后筛选治疗脂质异常、肥胖症、心血管病、糖尿病及肿瘤等疾病的新药提供了一种全新的、具有生物活性检测能力的药物筛选细胞模型。
1材料.............................................................................................................. 8
1.1质粒和细胞株............................................................................................... 8
1.2主要试剂..................................................................................................... 8
1.3主要实验仪器及耗材................................................................................ 9
1.4主要试剂的配制.......................................................................................... 10
2方法................................................................................................................11
2.1质粒扩增与抽提.........................................................................................12
2.2293T细胞的培养.......................................................................................... 12
2.3质粒共转染293T细胞................................................................................. 13
2.4药物干预..................................................................................... 13
2.5双荧光素酶报告基因检测法检测双荧...................................... 14
3结果.............................................................................................. 18
3.1转染PPARs墓因质粒293T细胞GFP表达情况.................... 18
3.2转染PPARs墓因质粒293T细胞药物……………………………..20
3.3药物干预状态下转染................................... 24
4讨论.................................................................................................. 33
5结论................................................................... 38
参考文献................................................................................. 39
文献综述...................................... 44
综述
过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisomeproliferator一 aetivatedreeeptors，PP从s)是一类由配体激活的核转录因子，属n型核激素受体超家族成员，包括PPARa、p/6、Y三种受体亚型。PPARs与维甲类X受体(RXR)形成异二聚体，然后与所调节基因的启动子上游过氧化物酶体增殖物反应元件 (Peroxisomeproli几 ratorresponseelement，PP贬)结合，从而发挥对靶基因的转录调控作用，并由此实现其诸多不同的生物学作用。PPRE通常是含有一个核昔酸间距的正向重复序列，不同物种来源的PPAR反应基因的PPRE序列略有差异，其中人PPR卫的共有核昔酸序列为AGGTCA一N一AGGTCA。
自上世纪90年代陆续发现几种PPARs受体以来，由于PPARs所显现出的重要作用，使得围绕PPARs受体功能和配体筛选的研究成为生物医学和药理学的前沿热点。大量研究表明，PPARS可能与肥胖、心血管病、糖尿病及肿瘤等疾病的转归有密切的关联，使得PPARs有望成为治疗上述常见顽疾的新的药物靶标。本文现就PPARY与疾病关系的研究进展做一综述。