第一章绪论
1.1 P53蛋白激活机制及相关激活小分子化合物
肿瘤是人类生存的一大公敌，不但直接威胁着人类的健康和生命，同时也给人们的生活造成很大的经济负担，所以不论在中医还是在西医，对其发生、发展、治疗进行着如火如茶的研究，针对某些肿瘤不断地找到一些合适的治疗药物或治疗措施。现代医学研究表明，肿瘤是由于环境因素和遗传因素造成的细胞恶性增殖与分化异常，在正常情况下，细胞的增殖受到许多因素的调控，调控失衡可能引起异常的增殖和持续分裂。
细胞周期调控的关键因素是细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin一dePendenikinases，cDKs)，cDKs属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，可在特定的细胞周期被激活，之后磷酸化相应的底物，从而引起后续事件的发生。此外，CDKs功能的实现还依赖细胞周期蛋白(cyclin)，此类蛋白在不同的细胞周期表达量不同，因而可以时相性地激活CDKS，而CDKs的时相性激活是细胞周期调控的核心。eoKs的活性可以被细胞周期抑制蛋白 (celleyelei雨bito叮protein，e心)所抑制。cKI可与cDK单独结合，也可与cDK一cyclin复合物结合而发挥作用。现已发现两种cKI家族:困K4家族和Cip肠p家族。INK4家族包括P15(INK4b)、P16K4a)、pls(INK4e)和p19(INK4d)，它们均可特性抑制eDK4/6。eip服ip家族包括pZI(Wafl)、p27(CipZ)和p57，可以广泛地作用于eyclin复合物并抑制它们的活性，特别是Gl期cDK4/6一cyclinLD复合物川。己知DNA损伤后会激活了相应的检查点机制，使细胞周期进程延缓或停滞，目的是修复损伤的DNA。检查点机制已被部分阐明，其中最为重要的是两个eheekpoint:(l)GI/s期检查点(2)GZ/M期检查点。DNA损伤可引起P53依赖的周期阻滞，正常细胞内P53的水平通常很低，DNA损伤刺激引起P53的表达和活性迅速升高。P53可引起多种基因转录，如P21、14一3一3。和Bax等的表达。如前所述，PZI是一种细胞周期抑制蛋白，通过抑制CDKS导致细胞周期阻滞，阻止损伤DNA的复制。当DNA无法修复时，P53便激活相关的凋亡基因如Bax、Fas等促进肿瘤细胞的凋亡。
在以上众多的与肿瘤相关的基因研究中，一个重要的基因是尸刀基因，它参与了细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA修复等细胞生命活动。鉴于P53基因在抑制肿瘤的中心地位，目前已有多种治疗肿瘤策略，激活P53蛋白是治疗策略之一，该治疗策略机理为:P53蛋白作为一种蛋白质，它的构象与翻译后修饰常常影响P53蛋白的活性。己有研究表明设计多肤结合于P53蛋白末端序列能增强P53蛋白转录活性，人类P53蛋白蛋白N端Ser巧和SerZO位点的磷酸化后通过抑制P53蛋白与MDMZ的相互作用而增强P53蛋白的稳定性[3]，由此可见翻译后修饰对P53蛋白的稳定与功能至关重要。目前已研发出多种针对P53蛋白精细化学结构以及各种修饰位点的抗肿瘤小分子化合物。因此，加深对P53蛋白的激活机制及其激活相关的小分子化合物的了解，不仅有助于对肿瘤发生机制的认识，而且可为进一步筛选小分子抗肿瘤化合物提供参考。
1.2抗肿瘤中药化合物文库
纵观上述小分子化合物的结构式，均是一些含芳香族或者含杂环的化合物。已证明有抗癌作用的中药作为巨大的天然药物文库，其中组分亦多有类似的结构。中医药是中华文明瑰宝，对肿瘤的发生和治疗的认识历史悠久。中医认为肿瘤是由于“毒、疲、虚”所致，所以对于肿瘤的治疗采用“扶正祛邪”的方法。“祛邪”手段与现代医学的化疗、放疗和手术等方法具有一定相似性。古时，手术方法治疗肿瘤很少，更没有放疗的方法，“祛邪”手段也就相当于今天的化疗。中草药复方中肯定含有针对肿瘤的有效成份，而其他的一些成份可能起到“扶正”的作用。现代的医学研究证明，中草药是治疗肿瘤的一个非常大的化合物文库，中草药中活性成分呈现复杂性和多样性，且大多数活性成分都是一些极性较强的物质如黄酮类、生物碱类、皂贰类、木脂素类、菇类、酸类、醇类、蕙醒类、酚类和糖类等。目前很多的化疗药物直接来源于这些中草药组份的纯化，或以其为前体进行改造，制出强效、副作用小的抗肿瘤药物。如:紫杉醇(Paclitaxel)，是从一种红豆杉属植物中提取的三菇类化合物，由于其对许多耐常规化疗药物的肿瘤具有活性，因此，1992年美国FDA首次批准用于治疗晚期转移性卵巢癌，后又批准用于治疗晚期转移性乳腺癌。目前已在美国、英国、加拿大、瑞典、奥地利等国家上市应用。
既然中草药是治疗肿瘤的一个巨大的化合物文库，如何从中筛选到有用的肿瘤治疗有效组份;如何在其中筛选到有靶向性的成份?这些是中药现代化迫切需要的问题。因此结合高通量筛选技术从中药文库中筛选与P53蛋白相互作用的小分子化合物，将成为探索P53蛋白激活机制及研发小分子化合物的新策略。
1.3双荧光素酶筛选技术及慢病毒载体的应用
高通量筛选(high一throug坤 utscreening，HTS)是在组合化学、基因组学、药理学等学科推动下出现的一项高效率大规模药物筛选技术，一般是建立以药物作用靶点为主要对象的分子和细胞水平的筛选模型，根据样品与靶点结合的表现，判断化合物的生物活性，所以说分子和细胞水平的实验方法[55}是实现高通量药物筛选的技术基础。标准的体外分子水平筛选技术具有微量、快速的特点，筛选结果准确，稳定，易于评价，但其检测模型只是到对特定靶点的单指标检测，提供化合物对靶点作用的有限信息，无法对化合物的生物活性进行综合评估;而细胞水平的高通量筛选比分子水平的筛选更快速全面反映被筛样品的生物活性，目前细胞水平的筛选方法主要有如下技术细胞水平重组技术，报告基因技术，荧光检测分析技术，荧光影像技术等。
第二章pLL3.7一Dluc载体的构建与鉴定..................................... 13
2.1材料与方法..................................................................................... 14
2.2结果.................................................................................................... 27
2.3讨论................................................................................................. 33
第三章慢病毒包装与鉴定.......................................................... 36
3.1实验材料与方法............................................... 37
3.2结果.................................................................................. 41
3.3讨论........................................................ 41
第四章细胞毒性试验及中药筛选实验............................................. 43
4.1材料与方法........................................................................................ 43
4.2结果.................................................................................................... 45
4.3讨论.................................................................................... 55
结论............................................................................................ 58
参考文献....................................................................................... 59
结论
细胞模型筛选是进行药物筛选研究的重要手段之一，己有很多研究组采用这种方法来筛选抗肿瘤小分子化合物，如何得到高效直观的细胞筛选模型，也是人们一直致力的研究方向。本研究以细胞水平筛选模型为基础，利用双荧光素酶筛选技术构建了基于PZI启动子的双荧光素酶筛选系统，取得以下几方面的结果:
1、成功地构建了pLL3.7一Dluc载体用于细胞模型筛选药物。
2、创新性地把 ReninaLuciferase和 FirelyLuciferase两个报告基因共同构建在PLL3.7载体上，能更有效的消除双质粒产生的转染效率差别。
3、利用两种细胞筛选模型进行药物筛选实验，初步实验结果表明了姜黄素、丹参酮nA、人参皂营Rbl对肿瘤细胞的P53蛋白有激活作用。药物筛选的实验结果只能初步说明姜黄素、丹参酮nA，人参皂营Rbl参与了P53途径，并未能证明这三种中药直接结合于P53蛋白。这三处中药的作用很可能是先与一些转录因子结合再作用于P53蛋白从而启动下游FirelyLuciferase基因的表达，或者是药物中的有效组份促进了P53基因的表达。在本实验中，慢病毒的包装实验不成功，包装条件还需要进一步的摸索，以便得到稳定表达的细胞株。此外，由于局限于实验材料的来源，仅仅是选择了食管癌Eca109，胶质瘤U251细胞及8种中药用于试验。
因此，本课题将继续从以下几方面进行完善与深化:
1、继续摸索慢病毒的包装条件来建立细胞株，达到稳定筛选的目的。
2、为避免双荧光素酶筛选的假阳性，应进一步做Westem一blot等实验来验证。
3、由于无法判断中药有效组份是靶向结合并激活P53蛋白，还是通过结合于尸53基因调控序列使P53蛋白表达升高，因此可利用中药芯片技术来筛选靶向激活P53蛋白的中药组份。应用液相色谱、质谱等技术对初筛的药物进行深入分离、鉴定，确定化合物组成将要有助于中药现代化的探索。