第一章胰高血糖素样肽-1的研究进展
胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是前胰高血糖素分子衍生出来的一种肠肽激素，是胰高血糖素原基因翻译后的加工产物，主要是由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌的。它主要有两种形式存在，GLP-1 (7-37)和GLP-1 (7-36) amideh2]，这两种肽具有相同的生物学活性，可以刺激胰岛素的分泌[，促进胰岛P-cell的增值、胰岛的再生,抑制-cell的调亡，并且能够抑制肠胃排空，增加饱腹感从而减少饮食量。GLP-1的肠促胰岛素作用是葡萄糖依赖性的，治疗糖尿病时不会出现低血糖症状，这些功能使GLP-1作为一种治疗2型糖尿病的有效药物但是GLP-1在体内会迅速被二肽激酶IV降解，其半衰期不2 niin,这极大限制了其生理作用的发挥。因此人们对GLP-1结构进行优化、重组、修饰或寻找类似物，以抵抗体内二肽基肽酶IV的切割作用。另外治疗糖尿病的给药方式也一直是医药界所关注的问题，为了提高糖尿病患者的生活及治疗质量，人们对口服给药方法进行了广泛的研究。因此本文就GLP-1的来源及分子结构、生物功能和作用机制及蛋白口服药物在糖尿病治疗上的研究现状两方面做一综述。
1970年GIP被发现作为一种重要的肠降血糖素后，研宄者们推测除了 GIP外可能存在第二种肠降血糖素在这时重组DNA技术的建立为可能存在的第二种肠降血糖素的鉴定提供了必要的方法。在20世纪80年代初，来自琵琶鱼胰脏的编码胰高血糖素原的cDNA被克隆。琵琶鱼有两个独立的胰高血糖素原非等位基因，land 11,其中一个编码胰高血糖素，另一个编码胰高血糖素相关肽（glucagon-re丨ated peptide, GRP) , Lund 等发现 GRP 基因序列与 GIF 有很高的同源性，暗示着琵琶鱼GRP-1可能是一种肠降血糖素。Lund等还发现相似的胰高血糖素原mRNA在琵琶鱼的胰脏和肠中表达，极大地支持了 GRP是一种肠降血糖素这一假说。接着来源于人和鼠肠中的胰高血糖素原mRNA被克隆，并且发现其序列与胰脏中的mRNA是一致的。
琵琶鱼GRP被发现不久，哺乳动物及人的胰高血糖素原cDNA被克隆。GRP-1被证明是一种有效的能够促胰岛素的肠降血糖素，并且是哺乳动物体内产生的GLP-1的同系物。然而也有一些GLP-1的类似物的生物学活性还没被鉴定。
GLP-1的生物学作用最先在胰岛细胞中发现，具有高效的依赖葡萄糖的促胰岛素分泌的作用。在体外对GLP-1捨抗剂exendin 的研究证实了 GLP-1的促胰岛素性质在鼠、拂沸属、人的胰岛内起着非常重要的作用。并且GLP-1受体突变的小鼠是没有糖耐受力的。当口服葡萄糖时，杂合GLP-1受体的小鼠也呈现出了不正常的升胰岛素的现象，降低了受葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平重要的是，随着周围葡萄糖水平的降低,GLP-1的促胰岛素活性逐渐减弱。依赖于葡萄糖的肠降血糖素GLP-1对低血糖是一种保护措施。葡萄糖与肠降血糖素之间的作用是由于糖酵解与激活GLP-1受体的cAMP信号转导的相互干扰所引起的。葡萄糖耐受被用来描述葡萄糖代谢与GLP-1在P细胞中活性之间的相互依存作用（GLP-1的功能需要葡萄糖的存在，同时使e细胞对葡萄糖的响应又需要GLP-1的存在）。GLP-1不仅能够剌激胰岛素的分泌，而且还能刺激胰岛素原基因的转录及胰岛素的生物合成。尽管如此，GLP-1并不完全是保障胰岛素原基因的正常转录，因为胰脏胰岛素mRNA转录水平在野生或者不能表达GLP-1受体的小鼠中是相类似的。即便这样，GLP-1的这些性质清楚的与横酷脲类降血糖药物区分开来，后者能够刺激胰岛素的分泌，但不能刺激胰岛素原的生物合成。有数据证明GLP-1可能会剌激小鼠和大鼠体内导管上皮细胞分化成e细胞在e细胞INS-中，GLP-1与葡糖的协作刺激涉及细胞增殖分化的转录因子（c-fos, c-jun, junB，zif-268, nur-77)基因的表达。
在哨齿动物、猪和人类做的大量研究己经证明GLP-1能够抑制胃肠道暢动和胃液的分泌，可以延迟胃的排空作用。当GLP-1与营养物质混合共同给食时，GLP-1这一功能的产生是由于甘油酯运输被减慢，胰岛素分泌被弱化[46]。血液中的GLP-1浓度与胃排空速率是紧密关联的，因为参与血液循环的GLP-1是受严格调控的。GLP-1的这一功能提示了 GLP-1抑制胃排空比其在糖代谢过程中的作用可能更重要。在2型糖尿病患者体内注射一定剂量的GLP-1后，可剂量依赖性的抑制胃排空，即使在不增加胰岛素水平的情况下，患者体内也能显著降低餐后血糖浓度。另外，GLP-1可以高效地抑制胃液分泌。
截短型GLP-1 是胰高血糖素原翻译加工后的产物，并由小肠L细胞分泌，它不仅能够依赖葡萄糖刺激胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌从而降低餐后血糖水平，而且诱导e细胞的增值和胰岛新生、抑制细胞的调亡，除了这些功能，GLP-1能抑制胃暢动，减少食欲。全长GLP-1 (1-37)是从胰岛中分泌，在小肠中也存在极少量。它在小肠中被特定的蛋白水解酶降解为GLP-1 (7-37)。目前大部分研究针对截短型GLP-1的作用，GLP-1 (1-37)的功能仍然不明确。最近，有研宄发现GLP-1 (1-37)能够抑制趋化因子诱导的人CD-4淋巴细胞的迁移，也有研宄证明GLP-1 (1-37)能够将胎鼠小肠上皮细胞转化成分泌胰岛素的细胞。然而GLP-1 (1-37)能否控制血糖这一功能还不清楚。因此本研宄通过糖耐量和药效试验检测GLP-1 (1-37)对体内血糖的调节作用，并且检测在动物血清中的稳定性及激活GLP-1R的作用，GLP-1 (1-37)可能作为治疗糖尿病的另一种新药，在理论和实际应用中都有一定的研究意义。
另外GLP-1在体内受DPP IV酶的降解，在体内的半衰期只有2-3 mitio因此寻求一种延长GLP-1体内半衰期，延长其生物活性的方法，成为目前GLP-1研宄的热点。国内外对GLP-1治疗糖尿病的研究方向之一是对其结构进行改变，以达到延长药物在体内药效时间的目的，进而有效的治疗糖尿病。例如诺华诺德公司研制的NN2211 (商品名Liraglutide)，其对GLP-1的Lys26上进行酷化，显著提高了 GLP-1的体内半衰期。也有研宄者在GLP-1的C端接上脂肪酸以与血楽白蛋白结合，从而增加其在体内的稳定性。这些衍生物与天然GLP-1相比半衰期显著延长，但是存在着制备和纯化上的困难，并且它们都局限于注射给药，不能应用于口服给药。由于口服给药系统使用方便，患者顺应性高，己成为当前的研究热点，因此本研宄对GLP-1结构进行改变，将Ala8突变为Ser8, Lys26突变为Gln26，Lys34突变为Asp34, Arg36突变为Thr36，得到tGLP-1结构，在此我们将GLP-1的DPP-4和胰酶酶切位点突变掉，以延长GLP-1的半衰期，达到增强抵抗DPP-4和胰酶降解的效果，从而使药物得以口服。又由于口服给药需较大剂量，本研宄采用基因串联表达的方法来大量表达蛋白tGLP-L
蛋白是一种亲水性高分子化合物，这一特性决定了它既不能通过细胞间空隙扩散，又难以与细胞膜融合，因此生物利用度较低。胃肠道含有大量的消化酶，将蛋白质转化为小分子化合物，冑肠道pH值对蛋白的稳定性、空间结构、溶解度均会产生影响，这些都成为蛋白吸收的障碍。且小肠上皮细胞负责肠道各种物质的吸收，亲脂性分子可以直接穿过细胞膜通过上皮细胞，而亲水性分子无法直接通过疏水性的细胞膜需要通过细胞与细胞之间的间隙通过上皮细胞。在该间隙连接中紧密连接（tight junction)为其主要障碍。而文献记载几丁质可以暂时性 i打开紧密连接，因此本研宄将几丁质与亲水性药物合并形成微粒，增加亲水性药物在小肠内的吸收，进而提升药物的生物利用度，研究有效的口服药物。
第二章胰高血糖素样肽-1 (1-37)的克隆、表达及分离纯化.........16
1.材料.............18
2.方法...........18
3.结果...........30
第三章 GLP-1 (1-37)性质的研宄............43
1.材料..............43
2.方法............46
3.试验结果..........51
4.讨论与分析...........51
第四章tGLP-1串联体的克隆、表达..........53
1.材料...........54
2.方法............56
3.试验结果...............61
4.讨论与分析.............62
第五章tGLP-l-C4融合蛋白的表达优化及分离纯化..........63
1.材料................64
2.方法..............66
3.试验结果............68
4.讨论与分析...........75
第六章几丁质-PGA包裹tGLP-1微粒的制备及性质研宄74
1.材料.............74
2.方法...............75
3.试验结果...............77
4.讨论与分析...........81
参考文献................84
4.讨论与分析
我们纯化得到的tGLP-l-C4蛋白是以包涵体形式存在，它可以被胰酶切开，并且通过检测tGLP-l-C4包涵体被胰酶作用前后的口服活性，结果显示包涵体本省没有活性，但被胰酶酶切后显示了活性，由于口服给药剂量较小，只有半个小时的活性。为了说明串联体tGLP-1比天然GLP-1药效好，通过腹腔与口服两种给药方式对比了二者的活性，结果显示tGLP-l-C4要比GLP-1药效时间长，说明tGLP-1-C4有更好的降血糖活性。
由于蛋白药物很容易被体内的酶降解，并且小肠上皮细胞扮演着隔开人体与外界环境的角色，亲脂性分子可以直接穿过细胞膜通过上皮细胞，而亲水性分子无法直接穿过疏水性的细胞膜，需要经由细胞与细胞之间的空隙(paracelluar pathway)通过上皮细胞，位于上皮细胞之间的蛋白质结合物tightjunction为paracelluar pathway的主要屏障，其功能为选择性吸收亲水性分子，正是因为小肠上皮细胞之间tight junction的阻遏，造成经由口服给药的亲水性蛋白质药物在小肠无法有效地吸收，进而影响药物治疗疾病的功效。为了克服这一障碍，根据研究报道几丁质能够暂时性打开tight junction，我们制备了几丁质聚谷氨酸微粒，借由几丁质打开小肠上皮细胞间的tightjunction的特性，将亲水性药物由药物载体带过小肠上皮细胞，提高药物的生物利用度，即延长tGLP-1的口服活性。通过检测tGLP-l-C4包裹前后的口服活性，发现包裹后的蛋白明显比不包裹时的活性要好，400nmol/kg的给药剂量药效时间可也持续3h,比未包裹的蛋白药效时间延长了 1.5h，并且不会出现血糖反弹升高的现象。另外，由于口服蛋白药物时，蛋白药物要通过胃，但是胃中pH为酸性，并且酪蛋白又在酸性条件下是较稳定的，因此为了使制备的微粒更稳定，蛋白的利用率更高，我们用酪蛋白再次包裹几丁质聚谷氨酸微粒，通过测定蛋白的口服活性，药效时间延长到了四小时。我们的研究结果表明tGLP-1被几丁质聚谷氨酸包裹形成微粒后降血糖活性明显得到了提高，有望成为一种新型的临床口服药物。由于本研究对Chitin-PGA-tGLP-l-C4只是做了初步研究，关于微粒的粒径、带电荷数，在血楽中的稳定性、在不同的pH条件下的稳定性以及药物的缓释等都需要进一步研究，并且提高蛋白包裹率也仍需要进一步摸索。这些将是未来需要完成的工作。