靶向融合防龋DNA疫苗的构建与体外细胞表达研究
【摘要】 目的 构建以人细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4, CTLA4 )为引导的抗变形链球菌( Streptococcus mutans, S•mutans )葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTFs)Ⅰ和表面蛋白PAc的靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P,检测其在真核细胞中的表达。
方法 利用RT-PCR方法从外周淋巴细胞中获得CTLA4胞外区和Igγ1恒定区基因并进行T-A克隆,获得携带CTLA4-Ig融合基因的重组质粒pGJ,选择合适的酶切位点,再克隆入融合防龋DNA疫苗pGLUA-P中,构建靶代写代发医学职称论文向融合防龋DNA疫苗pGJA-P,并转染CHO细胞系,用蛋白质免疫印迹实验检测其表达。
结果 重组质粒pGJ、pGJA-P分别含有CTLA4-Igγ1融合基因和CTLA4-、Igγ1、pac、glu基因序列。蛋白质免疫印迹结果显示,pGJA-P表达的抗原可以与特异性抗PAc抗体发生免疫反应。结论 成功构建了靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P,并可在真核细胞中正确表达。
【关键词】 龋齿; 疫苗,DNA; 链球菌,变异
Construction and expression in vitro of a targeted fusion anticaries DNA vaccine
【Abstract】 Objective To construct and detect the targeted anti-caries fusion DNA vaccine pGJA-Pencoding the A-P fragment of pac, glu fragment of gtfB and extracellular region of the human CTLA4 andthe Fc region of human Igγ1gene for the targeting antigen to APC•Methods The extracellular region ofthe human CTLA4 and the Fc region of human Igγ1genes were amplified by RT-PCR from humanlymphocytes, and the genes were cloned into pUCm-T vector respectively•After sequencing, Fc region ofhuman Igγ1gene was cloned to the downstream of CTLA4 gene fragment as the /recombinant plasmid pGJ•The fusion gene was then inserted into the plasmid pGLUA-P to get the recombinant plasmid pGJA-P•TheCHO cells were transfected with liposome and the expression of fusion protein in cultured supernatants weredetected using Western blotting•Results The plasmids pGJ and pGJA-P carried the CTLA4-Ig fusiongene and CTLA4-Ig fusion gene, A-P fragment of pac gene and glu fragment of gtfB gene respectively•The expressed protein could response to specific anti-PAc antibody•Conclusion The targeted fusion anti-caries DNA vaccine pGJA-P is constructed successfully and expressed in eukaryotic cells correctly•
【Key words】 Dental caries; Vaccines,DNA; Streptococcus mutans
龋病是一种主要由变形链球菌(Streptococcusmutans, S•mutans)引起的感染性疾病。细菌表面蛋白PAc和葡糖基转移酶(glucosyltransferases,GTFs)分别参与介导了细菌与牙面获得性膜的蔗糖依赖性和非依赖性的粘附过程。已构建成功的针对PAc的防龋DNA疫苗pCIA-P及同时针对PAc与GTFs的DNA疫苗pGLUA-P,经动物实验证实可诱发特异性抗体,确有防龋效果[1-3]。为了提高DNA疫苗激发的免疫效果,Boyle等[4]利用细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA4)将抗原靶向引导至抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)表面以增强DNA疫苗的免疫效能,效果甚佳。CTLA4主要表达于活化的T细胞表面,其配体B7分子广泛存在于APC表面[5]。CTLA4与B7分子有很高的亲和力,与免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)的融合又使融合蛋白具备许多优点,我们拟利用该特点构建携带CTLA4胞外区与Ig恒定区基因的靶向防龋DNA疫苗,并检测其在真核细胞中的表达,以获得1:次高相对分子质量标准;2:PAc阳性对照;3:经pGJA-P转染细胞培养上清:4:经pGJA-P转染细胞培养上清;5:未经pGJA-P转染细胞培养上清图3 抗PAc抗体蛋白质免疫印迹结果讨论DNA疫苗虽然具备传统疫苗无法比拟的优点,但仍存在免疫效能不高的问题。Boyle等[4]构建了融合小鼠CTLA4信号肽、胞外区序列与人Ig恒定区基因序列的真核表达质粒mCTLA4-hIg,以人Ig为抗原,免疫小鼠,证实了CTLA4-Ig能够增强DNA疫苗的免疫效能1 000~10 000倍。Lew等[8]认为靶向配体可以放大抗体与CD4 T细胞的免疫反应;增加了抗体反应速度;诱导的某种Ig亚型免疫反应对于增强疫苗的免疫效能有帮助;同时不会影响体内CTL的免疫反应。这对免疫防龋非常有利。Drew等[9]在mCTLA4-hIg序列后面克隆一段目的抗原基因,免疫小鼠后体液特异性抗体增加了30倍。CTLA4属于免疫球蛋白超家族,其配体B7分子广泛存在于APC表面。CTLA4以同源二聚体的形式与B7形成复合体,传递T细胞活化的共刺激信号[10],两者间具有极高的亲和力。CTLA4胞外区的MYPPPY基元,在不同种属的动物,包括人类高度保守。基于以上研究,并考虑到防龋DNA疫苗最终要进入临床应用,本实验将人CTLA4信号肽、胞外区序列克隆入融合防龋DNA疫苗pGLUA-P中,使表达的重组蛋白可以分泌出细胞并具有与APC表面的B7分子定向结合的能力。研究证实,APC在摄取抗原的过程中自身逐渐成熟并表达出更多的B7分子[11],APC结合了更多的抗原,从而增强了疫苗的免疫效能。因此本研究在融合防龋DNA疫苗pGLUA-P的前端克隆了人的CTLA4-Ig融合基因,期望采用靶向定位抗原至APC的方法来增强防龋DNA疫苗的免疫效果。贾荣等[3]研制的融合防龋DNA疫苗pGLUA-P,经动物实验证实可诱导特异性抗体产生,并可有效防龋。本实验在疫苗的上游克隆了CTLA4的胞外区基因序列与Igγ1的铰链区、恒定区的基因序列相融合的基因,而Ig的一些辅助功能使重组蛋白具备了一些新的特性:①Ig的恒定区使重组蛋白在体内更加稳定,半衰期延长[12];②引入的Ig片段增加了融合蛋白的免疫刺激作用,提供了免疫佐剂作用。本次实验构建的DNA疫苗正是以pGLUA-P为重要骨架,同时携带pac的A区、P区和GTF的glu序列;蛋白质免疫印迹实验证实该疫苗转染真核细胞后可以表达和分泌目标抗原,相对分子质量正确,与抗PAc抗体能发生抗原抗体反应,具备免疫反应性,说明了pGJA-P的构建是正确的。本实验成功构建了靶向融合防龋疫苗pGJA-P,并证实其能够在真核细胞中正确表达和分泌,具备免疫原性,为下一步靶向融合防龋疫苗的研究提供了基础。高效的新型防龋DNA疫苗。
材料与方法
1•CTLA4胞外区基因及Igγ1恒定区基因的获得:用RT-PCR方法对携带CTLA4信号肽和胞外区基因的重组质粒pGCTLA,及携带Igγ1恒定区基因的重组质粒pJIg进行T-A克隆构建,并进行测序鉴定[6,7]。
2•pGJ的构建与鉴定:将pJIg用KpnI和BclI进行双酶切,胶回收纯化后将Ig片段与同样经KpnI和BclI进行双酶切的pGCTLA4质粒在T4连接酶作用下进行连接反应,转化感受态细胞E•coliJM109(由武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室保存),接种于氨苄青霉素阳性的LB培养平板,37℃培养24 h。第2天挑选阳性克隆,酶切鉴定。所得重组质粒命名为pGJ。
3•靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P的构建与鉴定:将pGLUA-P(由本室构建)和pGJ分别用NheI和KpnI进行双酶切,pGLUA-P酶切后电泳回收包含部分载体序列和GLUA-P片段,pGJ酶切后电泳回收CTLA4-Ig片段,在T4连接酶的作用下进行连接反应,获得靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P,并转化感受态细胞E•coli JM109,提取纯化pGJA-P,电泳鉴定。
4•pGJA-P在CHO细胞系中的表达: CHO细胞系购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC),用无血清专用培养液(Hyclone)37℃、5%CO2培养。转染时将一定量的质粒和转染剂LipoVecTM(InvivoGen)混匀,室温孵育30 min,按一定比例加入细胞培养瓶中,37℃、5%CO2培养,并设空白对照。细胞培养48~72 h后吸取培养上清,8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,同时设立rPAc (TakahikoOho教授赠)重组蛋白作阳性对照。电泳后转印至硝酸纤维素膜,3%BSA/TBS封闭液室温摇振1 h,然后加入兔抗PAc蛋白抗体(Takahiko Oho教授赠)溶液(1∶1 000)4℃24 h。漂洗后加入HRP标记的羊抗兔抗体,室温下振荡孵育1 h。漂洗后加入DAB显色液显色10 min。
结果
1•代写代发医学职称论文重组质粒酶切鉴定:pGJ经KpnI单酶切得到了3 897 bp片段,经KpnI和NheI双酶切得到T载体2 705 bp和CTLA4-Ig融合基因1 192 bp片段;pGJA-P经NotI单酶切得到了8 304 bp片段,经KpnI和NheI双酶切得到CTLA4-Ig融合基因1192 bp片段和载体7 112 bp的片段,经KpnI、NheI和SalI三酶切得到原始质粒载体3 972 bp、pac 2262 bp、CTLA4-Ig融合基因1 192 bp、glu 878 bp的片段。电泳结果表明,pGJ和pGJA-P的插入片段大小与预期结果一致(图1,2)。1:λ/HindⅢ相对分子质量标准;2:pGJ经KpnI单酶切;3 pGJ经KpnI、NehI双酶切;4: pJIg经HindⅢ和EcoRI双酶切;5:pGCTLA经HindⅢ和EcoRI双酶切;6: DL2000相对分子质量标准图1 pGJ酶切电泳结果1:DL2000相对分子质量标准;2 :pGJAP经SalI、KpnI、NheI三酶切; 3:pGJAP经NotI单酶切;4:pGJAP经KpnI和NheI双酶切;5:λ/HindIII相对分子质量标准图2 pGJA-P酶切电泳结果
2•Western免疫印迹法检测结果:由CHO细胞表达并分泌出细胞的重组蛋白(160 000)可以和特异性抗S•mutans的PAc抗体发生反应,有阳性条带显示。空白对照无条带出现。而rPAc阳性对照在190 000处有条带显示抗体抗原反应(图3)。证实pGJA-P可以在真核细胞正确表达,其表达的蛋白具备免疫反应性。
参考文献
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