本文是一篇医学论文，本研究在体内水平明确了Pol蛋白上调控BLV复制的关键氨基酸位点，揭示了BLV感染初期的犊牛和稳定感染的成母牛免疫细胞表型和细胞免疫应答特征，为发掘调控BLV复制的关键病毒因子以及深入理解其与宿主间的互作提供了研究基础。
第一章 牛白血病病毒突变株的体内复制活性
1 材料与方法
1.1 BLV感染性克隆及实验动物
pCAGGS-BLV17985、pCAGGS-BLV17985-Q192R、pCAGGS-BLV17985-T250I、pCAGGS-BLV17985-S591P和pC AGGS-BLV17985-Q192R-T250I-S591P（pCAGGS-BLV2723）各感染性克隆质粒来自本实验室前期构建保存；实验动物为18头来自徐州永浩牧场的2月龄健康断奶荷斯坦犊牛（经抗原抗体检测确定为BLV阴性）。
1.2 主要试剂
基因组DNA提取试剂盒（High Pure PCR Template Preparation Kit）购自Roche；无内毒素质粒大提试剂盒（增强型）（Endofree Maxi Plasmid Kit V2）购自TIANGEN，货号为DP120；牛白血病抗体检测试剂盒（Bovine Leukemia Virus Antibody Test Kit）购买自Biovet（Canada），货号为TRM-506。
PBS缓冲溶液粉末购买自白鲨（Biosharp），货号为BL601A；DNA分子标准marker购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；转染试剂F-PEI（氟化聚乙烯亚胺）受赠于上海市调控生物学重点实验室；Taq DNA聚合酶和dNTP购买自Invitrogen。
2结果
2.1 BLV阴性犊牛的筛选结果
在正式试验开始之前，对徐州永浩奶牛场75头1月龄左右的小犊牛进行BLV检测（正式实验时犊牛大于2月龄，已经断奶，免疫系统接近成熟），首先通过阻断法ELISA检测犊牛是否有母源抗体，再对无母源抗体的犊牛通过FRET-qPCR进行BLV前病毒检测，两项检测结果都为阴性时方可判断为BLV阴性。筛选出的BLV阴性犊牛继续单独饲养于犊牛岛，用于饲喂的牛乳都经过高温煮沸灭菌，且这批犊牛实验期间不进行疫苗接种，偶有注射药物则严格更换针头；该奶牛场初生犊牛会在5日龄之前完成断角，因断角造成的BLV感染在正式试验开始前即2月龄前能够被检出。筛选出的18头犊牛在正式试验前7天和攻毒当天再进行一次BLV前病毒及抗体检测，确保实验牛是BLV阴性。通过筛选后的18头BLV阴性小犊牛的照片和饲养环境如图1-3所示：
第二章 牛白血病病毒突变株感染后宿主的免疫应答特征
1 材料与方法
1.1 BLV感染性克隆及实验动物 同本研究内容第一章1.1。
1.2 主要试剂
1.2.1 流式细胞术抗体
本研究所用流式抗体大部分是针对牛的单克隆抗体，部分是针对人的但与牛有交叉反应的抗体如CD27和CD44。本研究所用流式抗体如表2-1所示：
2 结果
2.1 BLV感染导致宿主淋巴细胞数量变化
在攻毒注射前及注射后的不同时间点，对各组犊牛的外周血进行了血细胞计数。具体的计数时间点包括注射后15天（未检测到感染）、28天（感染组检测到前病毒的中位数时间点）以及68天（前病毒载量稳定）。将同一时间点不同组犊牛的白细胞数量和组成与Mock组（即注射PBS的对照组）进行比较后发现，BLV感染初期，感染rB LV17985和rBLV19785-Q192R的犊牛外周血中淋巴细胞数量显著下降。然而，当BLV感染达到稳定阶段，即前病毒载量稳定之后，这些犊牛的淋巴细胞数量则恢复到了与Mock组相同的水平。与此同时，未造成B感染的rBLV19785-T250I组、rB LV19785-S591P组和rBLV17985-Q192R-T250I-S591P组犊牛的外周血淋巴细胞数量未出现此类变化。各组犊牛在不同采样时间点的淋巴细胞计数及其与Mock组的对比结果见图2-2（不显著的结果未列出）。
第三章 牛白血病病毒稳定感染后宿主的免疫应答特征 ....................... 41
1 材料与方法 ............................................ 41
1.1 主要试剂 .............................. 41
1.2 主要仪器 ........................................... 42
全文结论 .................................... 49
2 结果
2.1 江苏地区BLV流行病学调查结果
从江苏省三个分别位于扬州市、徐州市和泗洪市的奶牛场采集全血样本共224份，通过FRET-qPCR进行BLV诊断出共65份BLV阳性样品，其中扬州牧场BLV阳性率为15.38%（4/26），淮安牧场BLV阳性率40.35%（23/57），徐州牧场BLV阳性率41.84%（59/141）。各地BLV阳性样品数量及其前病毒载量见表3-3。
全文结论
1．通过体内实验明确了BLV Pol蛋白上两个关键氨基酸突变T250I和S591P对病毒复制的影响：BLV Pol蛋白上两个关键氨基酸突变T250I和S591P中的任何一个或者两个同时发生时都将使BLV失去体内复制能力，这与体外实验的结论相吻合。
2．BLV感染初期，宿主外周血中淋巴细胞数量先下降，后恢复至正常水平；BLV感染还导致宿主外周血中IgM+CD5+ B淋巴细胞增加而IgM-CD5+ B淋巴细胞数量减少；此外，rBLV17985-Q192R感染的犊牛的αβ-T淋巴细胞在28 DPI显著增加，rB LV17985感染的犊牛CD4+T细胞分泌的IFN-γ显著增加。
3．对比稳定感染BLV的成母牛和BLV阴性成母牛各淋巴细胞亚群数量发现：BLV阳性奶牛的外周血CD27+CD45R- B细胞亚群数量显著增加，而CD27+CD45R+ B细胞亚群则显著减少；BLV阳性奶牛中高表达CD44的γδ-T淋巴细胞数量显著减少,提示BLV稳定感染后对奶牛的免疫抑制。但以上三群淋巴细胞亚群数量的变化与奶牛外周血的BLV前病毒拷贝数无明显相关性。
参考文献（略）