本文是一篇医学论文，笔者通过对114份血液样本的分析，发现8个SNP标记表现出较差的多态性，MAF值小于0.1，不符合我们的筛选标准。这可能是由于UCSC数据库中公布的SNP标记的频率与中国北方汉族人群中的显著不同。
1材料与方法
1.1样品制备
1.1.1样品收集
本研究所有样本均来自中国山西省的健康志愿者。该程序由山西医科大学伦理委员会批准（编号:2021GLL052）。在解释了研究的目的和程序后，从所有志愿者处获得了知情同意。共从无关健康个体中收集了156份样本，年龄在19-35岁之间，包括114个外周血液样本（55名男性和59名女性）、12个唾液样本（6名男性和6名女性）、15个精液样本和15个阴道分泌物样本。从外周静脉中抽取100µL血液，保存在含有EDTA的抗凝试管中，保存在-20℃下。用微量离心管收集200µL唾液或新鲜射出的精液，然后保存在-20℃下。使用无菌棉签收集阴道分泌物，在室温下干燥至少1天，然后冷冻保存。
此外，收集了不同年龄阶段的18份血液样本，包括6名青少年（18岁以下）、6名中年人（36-59岁）和6名老年人（60岁及以上），以研究候选CpG标记与年龄之间的相关性。
1.2方法
1.2.1灵敏度分析
为了检测该CpG-SNP复合体系的灵敏度，分别使用15 ng、10 ng、5 ng和1 ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化。用三份血液样本重复实验。
1.2.2种属特异性验证
从鸡、鸭、大鼠、猪、牛、羊、狗和兔样本中提取基因组DNA，采用300 ng基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后用来评估该复合检测体系的物种特异性。人类血液样本用作阳性对照。
1.2.3混合斑分析
由于在犯罪现场获得的通常是含血液的混合斑，因此人工制备了一系列两两体液混合斑，以测试该复合检测体系用于区分不同法医场景中遇到的混合斑的适用性。由血液和其他体液（血液和精液、血液和阴道分泌物、血液和唾液）组成的混合斑分别以100:0、19:1、1:1、1:9、1:19、1:49、1:99和0:100的比例进行模拟。此外，从上述四种体液中提取的DNA以相等的比例混合，以模拟由多人生物材料组成的超级混合斑，从而进一步测试多重检测体系的效能。随后，对混合后的300ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理。
2结果
2.1灵敏度分析
通过逐渐减少输入DNA的量，从两个方面评估该复合检测体系的检测极限。对于个体鉴定，完整的SNP分型图谱需要15 ng基因组DNA（图2-1及图2-2）。23个SNP标记在北方汉族人群中的累积个人识别概率（CDP）为0.999983（表2-1）。当输入DNA降至10 ng时，36.23%的SNP标记（rs10848543、rs66687178、rs4640436、rs72876044、rs4796991、rs10419232和rs587712）丢失，16个SNP标记的CDP仍可达到0.9998。当输入DNA减少到5 ng时，SNP分型的成功率进一步降低，大约60.87%的SNP标记（rs11609960、rs10846771、rs7977743、rs10848543、rs66687178、rs35111552、rs11121529、rs2072110、rs6925308、rs4640436）丢失。此外，当输入DNA低至1ng时，约81.16%的SNP标记不能成功扩增。也就是说，可以检测到多达五个SNP标记（rs2072110、rs2744388、rs58775446、rs12302749和rs11827672）,CDP值降至0.9524或甚至更低。简而言之，随着DNA输入的减少，多重SNP检测体系的个体识别能力逐渐减弱。
然而，对于血液鉴定，图2-1及图2-3显示，随着DNA输入量减少到1ng，大多数CpG标记（大约85.96%）丢失，三个CpG标记（cg01022219、cg01022219和cg08792630）仍然可以被成功检测。因此，即使从血液样品中提取的DNA量低至1ng，也可以通过该多重CpG检测体系准确地鉴定血液。
2.2种属特异性验证
在鸡、鸭、大鼠、猪、牛、羊、狗和兔这八种动物中验证了复合检测体系的特异性。结果显示，在八只动物中均没有检测到目标产物，表明该体系表现出良好的人类特异性，详见图2-4。
第二部分 CpG-SNP 复合检测体系的法医学效能评估 ...................... 30
1 材料与方法 ....................... 30
1.1 材料 ......................... 30
1.2 方法 ................................. 30
3讨论
在这项研究中，我们对该体系在法医学应用中的效能进行了系统评估，包括灵敏度、由不同体液构成的不同比例下的混合斑、种属特异性、陈旧检材及降解检材的分析及CpG标记甲基化状态与年龄之间的相关性分析。此外，我们还评估了其在中国山西人群中的多态性以统计其累积个人识别概率。
对于该复合体系的灵敏度，应该注意的是，仅用1 ng的输入DNA就可以检测到血液的存在。然而，需要15 ng的DNA来获得用于个体鉴定的完整SNP图谱。因此，为了获得更全面的结果，建议该体系使用15 ng以上的基因组DNA。针对灵敏度相对较弱的情况，我们对实验流程进行了几次调整以尽量减少对DNA输入量的要求。与上述材料和方法中的细节相比，一方面，将亚硫酸氢盐转化过程中的DNA洗脱体积从35µL减少到20µL以浓缩DNA。另一方面，用于多重PCR反应的DNA体积从2µL增加到3µL，以提高扩增效率。不幸的是，该体系的检测灵敏度并未始终达到我们的预期。我们推测，这可能是由以下三个因素引起的。首先，亚硫酸氢盐处理中使用的苛刻条件（即高温低PH）可能导致几乎90%的基因组DNA降解[38-41]。其次，本研究使用的Epitect快速DNA亚硫酸氢盐试剂盒DNA回收率仅为50%[42]。第三，同时分析血液特异性CpG和相邻多态性SNP标记的策略导致几乎一半的靶片段长度超过250bp的现象。基于以上情况，需要足够的DNA来保证长片段的成功扩增，而一个反应中所有目的产物的多重扩增则需要更多的DNA。在未来的研究中，通过缩短复合CpG-SNP标记的长度可以实现靶片段的高效扩增。此外，基于温和反应条件的方法，如TET辅助吡啶硼烷测序（TAPS），是分析DNA甲基化标记物的首选方法[43]。此外，还可以应用更灵敏的检测平台，例如下一代测序（next-generationsequencing,NGS）或纳米孔测序（nanopore sequencing）。
4结论
在这项研究中，基于CpG连锁SNP复合标记构建了一个复合检测体系，用于血液及血液贡献者的鉴定。已经证明该体系显示出较好的灵敏度、种属特异性和稳定性。而且对混合斑的分析能力较强，尤其是不平衡的混合斑和各种体液组成的混合斑。值得注意的是，这是第一个开发的复合检测体系，不仅可以识别犯罪现场通常提取的四种体液，还可以准确识别血液贡献者。我们相信，随着更多血液特异性多态性SNP标记的扩充和检测限的提高，该体系将因其简便、稳定和易于推广的特点而在法医实践中发挥重要作用。
参考文献（略）