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第二章  背景回顾
2.1 糖尿病的流行病学
代写医学论文糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是由多种原因引起的以慢性高血糖为主要特点的代谢紊乱，其中2型DM约占95%，1型DM仅占5%。近年来随着社会经济的发展，人们生活方式的变化以及人口老龄化，DM在全世界广泛流行，成为继肿瘤、心血管疾病之后第三位严重危害人类健康的慢性病。据世界卫生组织（WHO）统计，全球目前有近2亿DM患者，估计到2025年这一数字将增加至超过3亿[1]。美国现有2000万DM患者，另外有5700万人处于DM前期阶段[2]。
随着经济的迅猛发展, 近20 年来我国DM的患病率也呈现快速增长的趋势。1980年全国14 省市30 万人的流行病学调查结果显示，20岁以上DM患病率仅0.67[3]。1994 年全国19 省市21 万人的调查，25岁以上DM患病率为2.5%，这一数字与同等发展水平国家的数据相近，比1980 年增加了近3 倍[4]。2009年最新的流行病学资料显示，目前在我国城镇人口中，20岁以上DM患者大概有4100万人，比国际DM联盟2003年推算出的3980万人多出100余万人，患病率已达11%，另外DM的发病年龄越来越提前了，30岁以上的人群DM患病率已达5%，其中男性患病率达7.3%，女性为3.6%，男性患病率超过女性的2倍[5]。我国现已成为仅次于印度的世界第二DM大国。专家预测，由于我国人口基数大，社会经济发展迅速，肥胖患者显著增加，人口老龄化等因素的影响，在不久的将来，我国DM人数将超过印度，成为世界上DM患者最多的国家。
     由于DM可以引起冠心病、脑卒中、失明、肾功能衰竭、截肢等严重后果，因此，DM及其并发症的防治给家庭及社会带来了严重的经济负担。2006年美国居民DM直接或间接费用共计达1740亿美元[2]，研究显示我国城市治疗2型DM及其并发症的年直接医疗费用高达187.5亿元，占卫生总费用的3.94%。无并发症2型DM患者年直接医疗费用为3726元，而有并发症2型DM患者的年直接医疗费用为13833元，是前者的3.71倍[6]。
2.2 糖尿病微血管并发症: 糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变
对于DM患者，真正可怕的并不是DM本身，而是DM并发症。微血管病变是DM发生最早，最常见的并发症，也是其它各种慢性并发症的病理基础。DM微血管病变主要表现在视网膜、肾、心肌、神经组织及皮肤等，临床上以糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）和糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）最常见。
2.2.1 DN的特点及分期
糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是全世界导致终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)的最常见原因[7]，因DN导致尿毒症死亡者约占DM患者的27-31%[8]。1型DM患者在发病10年后DN的发病率迅速上升，20-30年最高，累及发病率为40-50%[9]； 2型DM病人中DN的发病率相对较低，约占20%[10]。但由于DM病人90%为2型DM，因此，合并DN的绝对人数远远多于1型DM病人，特别是DM患者一旦发生肾脏损害，出现持续蛋白尿则病情不可逆转，往往进行性发展至终末期肾功能衰竭。
DM可以通过不同途径损害肾脏，这些损害可以累及肾脏的所有结构，包括肾小管、肾小球以及肾间质，DN的主要病理改变是细胞外基质的扩张，肾小球和肾小管基底膜的增厚，系膜基质的增加，最后进展至肾小球和肾小管间质硬化[11]。Mogensen根据DM肾功能和结构病变的演进及临床表现将DN分为5期：
①肾小球高滤过期：以肾小球滤过率(Glomerular Filtration Rate, GFR)增高和肾体积增大为特征，与此同时肾血流量和肾小球毛细血管灌注及内压均增高。这些初期改变是可逆的，经过治疗可以恢复，但不一定能完全恢复正常；
②正常白蛋白尿期：肾小球出现结构改变，肾小球毛细血管基底膜(Glomerular Basement Membrane, GBM)增厚和系膜基质增加，GFR多高于正常，这期尿白蛋白排出率(Urinary Albumin Excretion Rate, UAER)正常 (<20μg/min或<30mg/24h);
③早期DN期：这一期主要表现为微量白蛋白尿，UAE持续高于20～200μg/min(相当于30～300mg/24h)，初期UAE20～70μg/min时GFR开始下降到接近正常(130mL/min)。这一期血压轻度升高，降低血压可部分减少尿微量白蛋白的排出。GBM增厚和系膜基质增加更加明显，已有肾小球结节型和弥漫型病变以及小动脉玻璃样变，并已开始出现部分肾小球荒废；微量白蛋白尿预示了DM患者肾病的进展，研究显示如果不加干涉，将有20-40%的DM患者会进展至临床白蛋白尿，而且，微量白蛋白尿也是心血管发病增加的标志物[12-14]。
④临床DN期或显性DN期：主要表现为大量白蛋白尿，UAE>200μg/min或持续尿蛋白>0.5g/d，为非选择性蛋白尿。血压增高。GBM明显增厚，系膜基质增宽，荒废的肾小球增加(平均占36%)，残余肾小球代偿性肥大。临床DN期尿蛋白的特点，不像其他肾脏疾病的尿蛋白，不因GFR下降而减少。随着大量尿蛋白丢失可出现低蛋白血症和水肿，DM肾病性水肿多比较严重，对利尿药反应差，其原因除血浆蛋白低外，部分是由于DN的钠潴留比其他原因的肾病综合征严重。因为胰岛素改变了组织中Na+、K+的运转，无论是Ⅰ型DM病人注射的胰岛素或2型DM病人本身的高胰岛素血症，长期高胰岛素水平即能改变Na+代谢，使DM患者潴Na+，这一期GFR下降，平均每月下降约1mL/min；
⑤肾功能衰竭期：DM患者一旦发展为临床DN，由于肾小球基底膜广泛增厚，肾小球毛细血管腔进行性狭窄和更多的肾小球荒废，肾脏滤过功能即进行性下降，导致肾功能衰竭，最后病人的GFR多<10mL/ min，血肌酐和尿素氮增高，伴严重的高血压、低蛋白血症和水肿。
2.2.3 DR特点和分期
糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR )是DM最常见和最为严重的微血管并发症之一，已成为西方国家四大主要致盲眼病之一。据统计每年约有12,000～24,000新盲人是由DR所致[2,15]。我国的DR致盲者比非DR致盲者高25倍。预计到2030年，美国将有2500万，全球约有3亿DR患者[16]。一般认为1型DR的眼部病变比2型DR严重，25%的1型DM患者在确诊5年后发展为DR，10年和15年后DR比例均提高到50%以上[17]。2型DM在确诊后20年，几乎所有患者都有不同程度的视网膜病变[18,19]。
1985年中华医学会眼科学分会制定了我国DR严重程度分级标准 （表1。）。临床上根据是否出现视网膜新生血管为标志，将没有视网膜新生血管形成DR称为非增殖性糖尿病视网膜病变（Nonproliferative Diabetic Retinopathy, NPDR）（或称单纯型或背景型），而将有视网膜新生血管形成的DR称为增殖性糖尿病视网膜病变（Proliferative Diabetic Retinopathy, PDR）。
表1. 糖尿病视网膜病变分期标准
类型 分期 视网膜病变
单
纯
期 Ⅰ 有微动脉瘤或并有小出血
Ⅱ 有黄白色“硬性渗出”或并有出血点
Ⅲ 有白色“软性渗出”或并有出血点
增
殖
期 Ⅳ 眼底有新生血管或并有玻璃体出血
Ⅴ 眼底有新生血管和纤维增殖
Ⅵ 眼底有新生血管和纤维增殖,并发现视网膜脱离
视网膜毛细血管由内皮细胞、基底膜、周细胞3部分组成，其中周细胞对内皮细胞起支持作用，周细胞具有收缩功能，可调节视网膜毛细血管局部的血流量和血管通透性。DR的基本病理改变包括：①周细胞选择性的丢失；②基底膜增厚；③微血管瘤的形成；④内皮细胞增生；⑤新生血管形成。其中周细胞选择性的丢失是最早的病理改变，一旦出现新生血管即标志着进入PDR。
2.3 DN和DR的发病机制
2.3.1 DN的发病机制
DN的发病机制是多方面的，主要有以下几个方面：
(一) 血流动力学改变
DN早期GFR明显增高，同时常伴有肾血流量的增加和肾脏体积增大。其机制可能与高血糖状态有关。高糖状态时血浆渗透压增高，血容量增多，肾血流量增多。DN患者肾小球入球小动脉相对扩张，出球小动脉收缩，两者阻力之比减低，导致肾小球毛细血管高灌注和高内压，引起系膜基质扩张和基底膜增厚，肾小球局灶性硬化。另外，毛细血管内皮细胞受损，正常的肾小球滤过屏障受损，蛋白质滤过增加，导致肾小球功能丧失。
(二) 蛋白非酶糖化
高血糖可引起许多蛋白质，如血红蛋白、血清白蛋白，以及细胞外基质和细胞膜中的一些组织蛋白发生非酶糖基化，所形成的非酶糖基化终末产物（Advanced Glycation End-products, AGE）在化学上是不可逆的，一经形成，则不断累积于组织中，影响组织的结构和功能。DN的主要病理改变是肾小球GBM增厚和系膜基质增加，这一方面是由于GBM胶原的合成增加，另一方面则是由于基底膜上糖基化的胶原蛋白分子降解减少，由于蛋白糖基化导致胶原蛋白分子重排，硫氢氧化增加，胶原蛋白分子间共价交联增加，结果使胶原蛋白正常的降解减慢[20]。
(三) 多元醇通路活性增加与myo-肌醇代谢紊乱
细胞内葡萄糖可以激活醛糖还原酶（aldose reductase，AR）催化葡萄糖转变为山梨醇，然后在果糖还原酶的作用下转化为果糖。高血糖情况下AR活性增加，肾组织中的多元醇代谢活跃，使山梨醇果糖过度堆积。由于山梨醇不易透出细胞膜而果糖又很少能进一步代谢，以致细胞内山梨醇和果糖堆积，结果导致：①细胞高渗，肿胀和破坏；②醇糖和醛糖含量增加，醛糖增多使细胞外基质中胶原成分的非酶糖基化作用增强，胶原增加，醇糖增多导致胶原水分增加，基底膜增厚；③多元醇通路的活化导致细胞内肌醇降解，细胞内肌醇消耗和含量减少，使细胞膜磷脂酰肌醇合成受限，引起细胞膜Na+-K+-ATP酶活性降低并引起细胞功能与结构的异常[21]。
(四) 肾小球滤过屏障的改变
肾小球基底膜中蛋白聚糖的高度阴离子性，决定了毛细血管滤过屏障的蛋白选择性，研究发现DM肾组织中硫酸蛋白聚糖含量均减低。硫酸蛋白聚糖的电荷改变对DM或其他原因尿蛋白时肾小球的通透性改变起着重要作用。
（五）氧化应激
研究证实DM患者存在氧化应激增加，高糖状态下活性氧基团(Reactive Oxygen Species, ROS)产生增多，抑制了三磷酸甘油脱氢酶的活性，调节着多条信号通路，如PKC通路、多元醇通路、己糖胺通路及AGE形成等的表达，另外，还可激活NF-κB，上调黏附分子及炎性因子基因的转录[22]。
(六) 血液流变学异常
DN患者存在内皮细胞和血小板功能的异常。前者主要表现为：vonWillebrand因子合成增加[23]；组织纤溶酶原激活物活性降低或纤溶酶原激活物抑制物活性增高，导致纤溶活性降低；前列环素合成减少，对血小板的抑制减弱。血小板功能异常主要表现为血小板对二磷酸腺苷、胶原、花生四烯酸、凝血酶等诱聚剂敏感性增强；血栓素2合成增加，促进血小板聚集和血栓形成。DN患者血液流变学异常表现为血流速度减慢，血液呈高凝状态和微血栓形成。
2.3.2 DR的发病机制
(一) 糖代谢因素
代谢机制紊乱是DR产生的根本原因，高血糖可引起一系列的病理生理改变：①糖酵解过程紊乱：高血糖时，正常糖酵解过程受阻，糖不能经正常途径分解，激活山梨醇通路，山梨醇和果糖在细胞内堆积，细胞内渗透压升高，水渗入细胞引起电解质失衡和代谢紊乱；②脂代谢异常：高血糖可抑制周细胞对肌醇的摄取和合成，引起周细胞内肌醇含量降低，导致肌醇磷脂前体的减少和代谢异常。肌醇磷脂产物三磷酸肌醇和二酰甘油水平降低。后二者作为第二信使，其调控细胞增殖的功能也将发生紊乱，DNA合成受到抑制，周细胞增殖活力下降；③诱导周细胞调亡：Bcl-2是一种癌基因，若Bcl-2的表达受到抑制，则细胞则进入调亡程序。研究发现牛视网膜毛细血管周细胞在血糖水平波动的条件下，周细胞Bcl-2的表达几乎降为零，Bcl-2表达抑制的周细胞易进入调亡程序[24]；④非酶糖基化：高血糖状态下，蛋白质和DNA发生非酶糖基化，使得蛋白质的生物活性发生改变。胺基胍是此过程的抑制剂，能抑制AGE的形成，研究显示DM兔经给予胺基胍治疗后，能纠正DM诱导的视网膜毛细血管通透性增加，抑制视网膜无细胞毛细血管的形成和其他一些微血管损伤的进展[25]。
(二) 血液因素
①血液粘稠度增高，血流缓慢和组织供氧减少是DR发生发展的重要因素；②血小板黏附聚集作用增强，血小板黏附于血管内皮细胞促使血栓素A2的生成，使血管收缩并进一步使血小板凝集，可能是导致毛细血管闭塞的重要因素； ③DM患者红细胞凝集性增高和变形能力下降，不易穿过管径细小的毛细血管，加上血浆蛋白，如纤维蛋白原、α2球蛋白等含量增高，使血液粘稠度进一步加大，导致血管内皮损伤，管腔堵塞，微血栓的形成。
(三) 新生血管生长因子
DR患者新生血管增生是由于组织缺氧所诱导的一种代谢机制。视网膜缺血可触发正常视网膜血管发育时的血管生长反应机制，导致病理性的新生血管生长；视网膜新生血管常起于毛细血管无灌注区的边缘，这是DR新生血管生长的重要机制；视网膜组织有血管生长因子的受体，故血浆源性血管内皮生长因子也可促使视网膜新生血管的形成。实验研究表明，DM时视网膜毛细血管通透性增加，血管渗漏，渗漏液中含有血浆源性血管生长因子，因而促进新生血管生长。
(四) 氧自由基
DR患者血清脂质过氧化物含量明显增高，超氧化物歧化酶活力明显下降，说明氧自由基损害加重。氧自由基可以损害一些不饱和脂肪酸，使视网膜的盘膜，线粒体膜和内层网膜内的脂类受到不可逆破坏，膜中磷脂发生过氧化，使膜中蛋白质，酶和磷脂交链失活，膜的流动性和通透性发生改变，功能受损，甚至导致生物膜溶解和细胞死亡，促使视网膜病变加重[26]。
2.4炎症反应、炎性因子与糖尿病和糖尿病并发症
2.4.1 糖尿病是从代谢紊乱到炎症反应的一个逐渐发展过程
早在1998年，有人就提出一个猜想：长期的先天性免疫系统的激活，导致了慢性炎症，引起2型DM的发生。在以后的几十年里，大量研究证明DM是一个从代谢紊乱到炎症反应的逐渐发展过程，慢性低度炎症和2型DM的发生风险紧密相关。2型DM患者在发病前数年，即早期糖耐量受损的阶段炎症反应即已存在[27-29]。成年印帝安人群是2型DM的高发人群，研究发现白细胞计数在最高三分位数的印帝安人与带有最低三分位数的印帝安人相比，2型DM的发生风险显著增加[28]。与此相似，美国一个前瞻性队列研究和MTDCD(Monitoing of Trends and Determinants in Cardiovascular Disease)研究都显示，健康中年妇女或男性，如果炎症标志物IL-6、C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）的水平在最高四分位数者，在以后4-7年的随访时间内，DM的发病率显著增高。
慢性炎症引起2型DM的机制尚不清楚。现在认为慢性亚临床炎症与胰岛素抵抗综合征相关[30-31]。促炎细胞因子和急性阶段炎症反应物参与了与胰岛素抵抗相关的多个代谢通路的调节，包括胰岛素的调节，活性氧的产生，脂蛋白脂酶的活性和脂肪细胞的功能等。
胰岛素抵抗在2型DM早期，即糖耐量受损的阶段即存在。与胰岛素抵抗发生密切相关的几个因素是：遗传、环境因素，肥胖和其它一些情况，比如慢性炎症和感染。众所周知脂肪组织能够合成和释放促炎细胞因子，如TNF-a、L-1、IL-6 等。肥胖，特别是脂肪组织的激活可能引起炎性因子的释放增加。在与肥胖相关的胰岛素抵抗发生模型中，脂肪细胞，一旦被激活，就会释放各种生物活性分子，如脂类、脂肪酸、MCP-1和炎性细胞因子，如CRP、血纤维蛋白溶酶原、TNF-α等，这些细胞因子和其他一些炎症介质的释放，导致脂肪组织中单核细胞的局部募集，单核细胞分化为巨噬细胞，进而使脂肪组织和系统内其他一些炎性因子和趋化因子的局部释放增加，促进了炎症反应在各个组织中的传播。
在一个肥胖糖尿病动物模型中，脂肪组织和血浆中均存在TNF-αmRNA 和蛋白的表达，采用TNF-α受体IgG嵌合蛋白抑制该动物TNF-α的表达后，胰岛素敏感性也提高了，表明TNF-α对于胰岛素抵抗具有直接作用。目前认为TNF-α和其它一些炎症介质诱导2型DM胰岛素抵抗发生主要是通过激活细菌脂多糖刺激I-KB激酶β（Lipopolysaccharide stimulate I-kappa-B kinase-β(IKKβ)/核因子-KB（Nuclear factor-kappa B,NF-KB）通路，NF- KB被激活后，移位至细胞核内，进一步促进了与胰岛素抵抗相关基因的转录。IKKβ基因杂合子缺失的肥胖小鼠，出生后23周内若被喂以高脂饮食，结果其对胰岛素抵抗具有保护作用，与IKKβ基因正常小鼠相比，空腹胰岛素水平和血糖水平显著降低[32]。双水杨酯，一种非乙酰基化的水杨酸制剂和IKKβ/ NF-KB通路的破坏剂，临床研究发现肥胖的非DM成年人，在用双水杨酯治疗后，胰岛素的敏感性提高，游离脂肪酸和循环中CRP水平降低，抗炎因子脂联素水平增加[33]。
2.4.2 慢性炎症与DN
2.4.2.1 慢性低度炎症参与了DN的发病
代谢和/或血流动力学因素曾被考虑为DN患者肾脏损害的主要原因，然而近几年，这种传统的机制已经被认为只部分解释了DN发生和/或进展的机制。在一些DM患者的肾脏中存在炎症细胞的浸润；Furuta et al在中等程度的DN患者的肾脏组织中发现了相当程度的巨噬细胞浸润[34]；另一些研究者也报道巨噬细胞浸润不仅存在于DN患者肾小球内，而且也存在于肾间质内[35]。另外，在实验性DM动物模型中，通过放射或免疫抑制制剂来抑制巨噬细胞浸润可以减轻DM肾小球损害的发展或进展[36-37]。巨噬细胞浸润的第一步是单核白细胞黏附到血管内皮细胞上，这个过程需要一些黏附分子，如细胞外黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、E-选择素、P-选择素、或趋化因子，如MCP-1等。在DN患者和DN动物肾脏组织中ICAM-1、E-选择素和P-选择素表达上调[38]；Okada et al报道对于链脲霉素诱导的DM大鼠，ICAM-1基因敲除6个月后可以阻止白蛋白尿、肾小球增生和肾间质硬化的进展[39]。然而，在最初注射链脲霉素后的一个月内，ICAM-1裸鼠和野生型鼠在白蛋白尿的程度上没有显著差异，提示在DM肾脏中观察到的低度炎症可能与肾病的进展相关，而与其发病无关。上述研究结果均表明慢性低度炎症或者称亚临床炎症在DN的发病机制中可能扮演着非常重要的角色。
2.4.2.1 促炎细胞因子与DN
1991年Hasegawa et al首次报道促炎细胞因子参与了DN的发病。当巨噬细胞与DN大鼠的肾小球GBM共同孵育后，较与正常大鼠的肾小球GBM共同孵育相比，产生了更高水平的IL-1和TNF-a[37]。目前已经知道许多促炎细胞因子, 如IL-1、IL-6，IL-18, TNF-α，MCP-1等均参与了DN的发病[40]。
（一）IL-1
DN患者肾脏IL-1表达表达上调，而且与趋化因子和黏附分子的表达水平相关。IL在DN中的作用有：①诱导肾小球内皮细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞合成和表达ICAM-1、血管细胞黏附分子-1（Vascular cell adhesion molecule -1,VCAM）以及E-选择素[37,40-42] ；②肾小球间血流动力学异常与系膜细胞合成前列腺素有关，而IL-1也参与了肾小球间血流动力学异常。采用重组的人类IL-1处理肾小球系膜细胞可能诱导前列腺素-E2合成和释放磷脂酶-A2，另外，IL-1可使系膜细胞前列腺素-E2对血管紧张素II的反应性增加[43]；③IL-1可以引起近端肾小管上皮细胞透明质酸的产生异常。体外实验显示IL-1刺激近端肾小管上皮细胞后其透明质酸表达显著增加[44]；④IL-1也可以直接影响血管内皮细胞的通透性。
（二）IL-6
Suzuki et al. [45] 通过高通量双杂交技术分析了DN患者的肾脏活检标本，发现系膜细胞，间质细胞和小管上皮细胞IL-6的mRNA表达是阳性的，而且，肾小球细胞系膜细胞和足细胞IL-6mRNA的表达水平与系膜扩张的程度存在显著正相关性。也有研究显示2型DM患者血清IL-6水平和肾小球GBM增厚程度显著相关，后者是DM患者肾脏损害的关键标志物和肾脏进展程度的强烈预测因子[46]。DN患者血清和尿液IL-6水平显著增加，且尿中IL-6水平与尿白蛋白排泄量直接相关[39,47]。IL-6介导的肾损害主要与内皮细胞通透性的改变，诱导系膜细胞增殖和上调纤维连接蛋白的表达有关[48-49]。
（三）IL-18
IL-18是一种强有力的炎性细胞因子，通过诱导IFN-γ的表达，反过来诱导人类系膜细胞上有功能的趋化因子受体的表达。另外，IL-18也能诱导其他一些炎性细胞因子的产生（包括IL-1 和TNF-α)，上调内皮细胞ICAM-1的表达，促进内皮细胞的调亡[50-52]。单核细胞、巨噬细胞、T 细胞，以及近端肾小管细胞均可合成和释放该细胞因子[53,54]。DN患者血清和尿液IL-18水平增加，而且与尿白蛋白排泄量独立相关[51-52]。另外，尿β2微球蛋白（β -2 Microglobulin，β -2MG）水平是肾小管间质损害的一个标志物，其水平也与血清IL-18水平相关[55-56]。
（四）TNF-α
TNF-α是一种多向性的炎性细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞和T细胞产生。另外，内源性的肾脏细胞，如系膜细胞、肾小球细胞、内皮细胞、树突细胞和肾小管细胞也能够产生TNF-α[57-59]。TNF-α对肾细胞是有细胞毒性的，能够直接导致肾脏损伤[60]。另外，有报道TNF-α与细胞的调亡和坏死有关[61]；TNF-α能引起血管收缩剂/扩张剂之间的失衡而导致肾小球间血流变化和GFR改变；TNF-α改变细胞与细胞黏附过程中黏附受体的分布，阻止肌动蛋白应力纤维的形成，结果引起细胞连接点的重构，引起内皮通透性的改变。另外，TNF-α可以直接诱导各种细胞，包括系膜细胞上ROS的产生 [62-63]。
许多实验研究发现DM大鼠肾小球和近端肾小管TNF mRNA和蛋白水平增高 [64]。TNF-α对近端肾小管细胞上钠的重吸收具有刺激作用，DM大鼠尿TNF-α排泄增加，伴有钠储留和肾肥大[65]。更重要的，采用微透析技术显示DN患者肾间质液和尿液中TNF-α水平显著增加，并且先于尿白蛋白的出现，而且在尿白蛋白增高后不久，尿液TNF-α浓度也显著增加了，表明尿白蛋白对肾脏TNF-α的产生具有刺激作用[66]。最后，一些临床研究也提示TNF-α参与了DN的发病过程。DN患者血清和尿液TNF-α水平显著升高，且其水平与肾小球和肾小管间质损害的临床指标具有独立相关性 [67-68]。
(五) MCP-1
MCP-1/CCL2是目前DN发病机制研究中最为关注的一种趋化因子。单核细胞以及肾脏局部细胞，如肾小管上皮细胞，内皮细胞和系膜细胞都能够合成MCP-1 [69-70]。MCP-1在募集巨噬细胞/单核细胞，介导肾损伤中扮演着重要角色。肾组织内内浸润的巨噬细胞/单核细胞进一步释放各种物质，包括溶酶体酶、一氧化氮、ROS以及TGF-β，导致了肾脏结构的损伤和功能的改变。尿液MCP-1水平显著增高，并且与小管间质内浸润的CD68阳性巨噬细胞/单核细胞的数量相关[71]。Tashiro et al.报道2型DM伴有肾病者尿液MCP-1水平随着肾病的不断进展，其水平逐渐升高[71]。另外，研究显示日本2型DM患者尿液MCP-1水平与N-乙酰葡糖胺酶水平和白蛋白尿水平显著相关[72]。N-乙酰葡糖胺酶是肾小管功能损害的一个重要标志物。肾小管上MCP-1的高表达可能导致了肾脏的损伤，同时，显著增高的蛋白尿本身就可以通过上调肾小管上MCP-1的表达而促进肾小管间质的损害。高糖能够刺激人类系膜细胞MCP-1的表达。Ha et al.报道高糖激活了蛋白激酶（Protein Kinase C, PKC)的活性，导致了活性氧代谢产物的产生以及NF-kappaB通路的激活，刺激了肾脏系膜细胞上MCP-1的表达[73]。AGE与其受体RAGE结合后，促进了足细胞的调亡，上调了MCP-1的表达[74]。
2.4.2.3 炎性细胞因子与DN的遗传性
高血压、高血糖和白蛋白尿是DN公认的主要危险因素，但它们并不能解释所有DM个体之间肾病进展的速度差异。DN发生和进展的速度有很大个体差异。另外，肾脏疾病具有家族聚集性，表明遗传因素参与了DN的发病。
带有几个等位基因多态性位点的细胞因子基因通过影响核转录和细胞功能，参与了人类一些疾病的发生。因为促炎细胞因子调节着DN的病理过程，因此这些基因的变化可能影响人类DN的易感性。编码IL-1和IL-1受体拮抗剂（IL-1 Receptor Antagonist  IL-1RA）的基因位于2号染色体的长臂上。IL-1β基因启动子-511和外显子5+3953部位有两个硷基的互换（C→T）, IL-1RA2号内含子部位包括86bp的串联重复序列。IL-1β等位基因2（-511 C/T多态性）和IL-1Ra等位基因（2个拷贝的重复序列）与DN有显著的相关性[75-77]。编码IL-6的基因位于染色体7p21，而IL-6受体（IL-6R）的基因位于染色体1q21，这两个基因上都有多个多态性位点。IL-6基因启动子634处的A C/G多态性是DN的一个强有力的遗传易感基因。Kitamura et al发现 IL-6基因启动子634 G/G纯合子在日本人中与2型DM患者微量白蛋白尿的程度阳性相关[78]。Wang et al[79]也报道IL-6基因V385I多态性位点与2型DM和DN发病相关。TNF-α基因位于染色体6p，具有多个多态性位点和双核苷酸重复序列（GA)，其中TNF308位点的多态性与2型DM患者肾衰竭增高的风险显著相关。
2.4.2.4 抗炎-DN治疗的新策略
尽管严格控制血糖和血压，以及肾素-血管紧张素系统阻止剂对于DN的治疗取得了一些益处，但是这些策略对DN的进展仅提供了不完全的保护作用。这些不完整性需要探索新的针对DN原始发病机制的治疗策略。越来越多的证据强调炎症机制在DN发病机制中的作用，因此，抗炎策略可能提供新的治疗方法。实际上，肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻止剂，是最近DN的主要治疗策略，他们就具有多元化的抗炎活性。其它一些新的针对DN炎性分子和通路的治疗方法正在研究当中。
麦考酚酸酯，一种具有免疫抑制作用的抗炎药物，最近有人报道它能阻止DN患者白蛋白的进展和肾小球的损伤，其作用与对肾小球血流动力学的影响或代谢控制的提高无关，因此，有人推测其治疗作用可能与它的免疫抑制作用和抗炎作用有关[80]。Moriwaki et al最近报道抗TNF-α抗体嵌合体，英夫利昔治疗糖尿病大鼠后，出现了尿白蛋白的减少和尿TNF-α的排泄降低[81]。/ 己酮可可碱（Pentoxifylline, PTF)是甲基黄嘌呤来源的一种磷酸二酯酶抑制剂，具有显著的抗炎作用，这种药物能够抑制TNF-α基因的转录，下调TNF-αmRNA水平[82-83]。实验研究显示PTF阻止了DM时肾脏TNF-α的表达、合成和排泄，而且与肾脏钠储留的减少和尿白蛋白排泄降低直接相关。另外，临床研究也表明PTF显著降低了DM患者肾小球和肾小管间质损害的临床指标水平。电泳分析显示，PTF治疗既能减少尿液中高分子蛋白，如Ig G、血浆铜蓝蛋白、输铁蛋白、白蛋白的排泄，也能减少低分子蛋白，如α1-抗胰蛋白酶、α1-酸糖蛋白、胶原酶抑制剂、α1-微球蛋白、胰蛋白酶抑制剂、溶菌酶和β2-MG等的排泄[84]。有人对比了PTF和血管紧张素转换酶抑制剂对2型DM患者的抗蛋白尿作用，结果发现，PTF与卡脱普利具有同等的治疗效力和安全性。而且PTF联合肾素-血管紧张素系统阻止剂，如血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素II的受体阻滞剂，可以产生叠加的效果，显著减少尿白蛋白排泄[85]。
2.4.3 慢性炎症与DR
2.4.3.1 DR发病过程中的炎症表现
许多与炎症相关的代谢和分子异常已经在DM患者或动物的视网膜上，以及体外暴露于高糖浓度的视网膜细胞上被发现。
(一) 白细胞增多
白细胞被吸引和黏附至血管壁上是炎症过程的一个重要方面。DM时白细胞通过黏附分子黏附到视网膜血管上。DM增加了人类和动物视网膜上ICAM-1的表达，视网膜内皮上的ICAM-1与单核细胞和中性粒细胞上的CD18黏附分子促成了DM患者视网膜血管上白细胞的增加[86]。DM动物的视网膜上白细胞显著增加，可能导致了毛细血管的无灌注[87]。其它证据显示白细胞增多也是DM患者视网膜内皮细胞调亡的一个原因。用原位灌注的方法，已经观察到白细胞增多导致了视网膜毛细血管的阻塞。ICAM-1或CD18缺失的DM大鼠未出现DM诱导的白细胞增多，血管通透性增加和视网膜毛细血管的退化等改变，说明ICAM-1或CD18对于视网膜病变的发展是十分重要的[88]。然而，他们在视网膜病变发展过程中所起的作用是由于毛细血管阻塞还是其它机制目前尚不清楚。
(二) 血管通透性增加
血-视网膜屏障的破坏，是DR发生过程中另一个早期特征，其可能与白细胞、细胞因子和生长因子的增多相关。血-视网膜屏障通透性的增加是DR患者公认的改变之一，这些缺陷导致了DR患者视网膜的水肿和视力的损害。
(三)  ICAM-1
白细胞黏附到内皮细胞表面的ICAM-1上是白细胞黏附到内皮细胞壁的步骤之一。DM患者视网膜血管上白细胞增多，其主要通过ICAM-1介导。VEGF、PARP激活剂、氧化应激、血脂异常均能够上调ICAM-1的表达。最近遗传修饰的C57B1/6J小鼠被用来研究ICAM-1和它白细胞上的配体（CD18)在DR中的作用。这些基因缺陷的小鼠和它们的野生型小鼠被用来诱导实验性DM，经过11个月后，野生型DM动物出现了毛细血管退化，周细胞的丢失，白细胞增多，毛细血管通透性的增加和毛细血管基底膜的增厚。对比之下，CD18−/−和ICAM-1−/−小鼠很少出现这些异常，提示这些炎症蛋白参与了视网膜的发病过程[89]。
2.4.3.1 细胞因子与DR的发病
（一）VEGF
VEGF在血管生成的过程中起中心调控作用，是启动新生血管形成所必须的物质。不但对胚胎期的血管生成有作用，同时也参与DR发病过程中新生血管的形成[90]。通过高亲和力酪氨酸激酶受体调节内皮细胞和周细胞的功能，引发PDR和其他缺血性视网膜疾病的病理性血管增生和血管重塑。在正常视网膜内，仅神经视网膜、脉络膜以及视网膜色素上皮层存在少量的VEGF。而DR患者视网膜的各层都可发现明显增强的VEGF表达[91-92], 多种视网膜细胞，包括神经节细胞，Mueller细胞和周细胞都可合成VEGF。PDR患者血清和眼内液中VEGF含量呈现高表达[93-96]。给非DM猴子的眼睛重复注射高浓度的VEGF，可以造成类似于早期DR的改变，如血管扭曲和微动脉瘤[97]。临床试验用抗VEGF治疗显示阻止了进展至晚期DR[98-101]。
(二) ILs 系统 
大量实验表明IL-1、IL-6、IL-8均参与DR的炎症反应过程。IL-1具有促进T淋巴细胞活化增生，趋化单核和嗜中性粒细胞，促进新生血管形成，刺激胶质细胞、成纤维细胞增生等活性。在DM大鼠的视网膜上促炎细胞因子IL-1β的水平增加[102]；静脉注射IL-1β，或体外暴露视网膜内皮细胞于中IL-1，能够造成视网膜毛细血管内皮细胞的调亡[103]。DM小鼠，半乳糖喂养的小鼠，DM患者以及视网膜M¨uller细胞在高糖浓度下，半胱天冬酶-1的活性增加[104]。用米诺环素抑制半胱天冬酶-1的活性可以抑制DM诱导的IL-1β增加，降低这些动物视网膜毛细血管的退化。另外，IL-1β受体敲除的小鼠抑制了IL-1β信号，阻止了DM诱导的视网膜病变[105]。这些结果显示，半胱天冬酶-1的激活和IL-1β的进一步产生在DR中扮演着重要的角色。
IL-6可促进粒细胞和巨噬细胞增生, 刺激成纤维细胞、胶质细胞增生。与IL-1有协同作用。同时可通过上调VEGF表达促进新生血管形成和增加血管通透性。IL-8 具有趋化嗜中性粒细胞、淋巴细胞和促进血管生成的功能，PDR患者血清和玻璃体内IL-8水平升高。而且随着DR的进展，IL-8含量逐渐增加[106-107]。
(三) TNF-α 和其它一些细胞因子
TNF-α可介导生长调节、炎症、细胞毒性、免疫调节、神经内分泌等多方面的效应。TNF-α在血管内皮细胞表面广泛分布，可增加视网膜血管通透性，刺激血管外基质过量产生和血管细胞的增殖，导致眼内新生血管形成。DM大鼠视网膜TNFα水平显著增高[108]。Eternacept是一种可溶性TNFα受体，能作为一种竞争抑制剂来阻止TNFα结合到细胞上。对于 1周的DM大鼠，Eternacep减少了白细胞黏附到视网膜血管，抑制DM时视网膜血-视网膜屏障的破坏和NF-κB的激活[108]。Sfikakis et al研究发现，DR 患者在应用抗TNF-α抗体治疗后，黄斑水肿明显减轻。提示TNF-α可能促进DR发展[109]。糖基化修饰的白蛋白或高糖刺激视网膜前膜和培养的Muller胶质细胞后，后者MCP-1mRNA和蛋白的表达水平增高[110]，这些研究提示MCP-1在NF-κB的调节下，参与了DM诱导的视网膜炎症。
2.4.3.2 针对视网膜炎症的治疗策略
（一）血管生成素-1 (Angiopoietin-1，Ang-1）
Ang-1有抗炎特性，包括抑制血管的通透性和黏附蛋白的表达。DM大鼠玻璃体内给予Ang-1后，血-视网膜屏障，白细胞增多以及内皮损伤恢复正常，抑制了视网膜VEGF，ICAM-1 mRNA和蛋白的表达上调[111]。
（二）抑制NF-κB通路
①PARP
PARP抑制剂，PJ34，显著抑制了9个月龄的DM大鼠视网膜微血管细胞的调亡和DR的早期改变，包括毛细血管的退化。有证据表明，这些抑制剂发挥作用部分是通过转录因子NF-κB的抑制，部分是通过NF-κB的p50亚单位。在胎牛视网膜内皮细胞上，PARP直接和NF-κB的亚单位作用，阻止了高血糖诱导的NF-κB增加和促炎因子基因的表达[112]。
②抗氧化剂
研究显示抗氧化剂抑制了DM动物视网膜上炎症改变的进展，包括NF-κB的激活，白细胞的增多，iNOS的表达增多，无细胞组成毛细血管的形成和周细胞的丢失[113]。维生素E（α-生育酚）、抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、硒的混合剂、或α-生育酚和硫辛酸显著抑制了啮齿类DM动物视网膜无细胞毛细血管的形成。抗氧化剂和降脂药，尼卡那汀，也可显著抑制DR时视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞数量的改变，但对无细胞毛细血管的形成没有影响。
③苯磷硫胺
苯磷硫胺是一种脂溶性的硫胺素来源的衍生物，能够显著抑制高血糖诱导的视网膜异常，包括NF-κB的激活。另外，苯磷硫胺也能显著抑制DM大鼠无细胞毛细血管的形成[114]。
④AGE和其受体
AGE结合到它们的细胞外受体上，诸如RAGE，会产生各种细胞内作用，包括促进NF-κB的激活和白细胞的增多。药理学干涉阻断RAGE-配体的结合抑制了DM诱导的视网膜毛细血管的退化，但是该作用是否通过抑制NF-κB通路目前仍不十分清楚。
④皮质激素类
众所周知，皮质激素类有抗炎作用。玻璃体内注射这种类固醇抑制了DM诱导的视网膜血管通透性增加和视网膜水肿。
⑤阿斯匹林和水杨酸盐
阿斯匹林通过抑制环加氧酶的活性抑制了前列腺素的产生。柳氮磺胺吡啶和水杨酸钠虽然活性较低，但是水杨酸能抑制DM大鼠视网膜的退化，它们抑制视网膜病变的作用是通过NF-κB的抑制。然而，这些是通过直接作用还是间接作用目前尚不清楚。
（三）醛糖还原酶抑制剂
醛糖还原酶抑制剂能够抑制高血糖下的AR，这种药物治疗动物糖尿病视网膜病变有作用，但对于DM患者未发现显著的作用。最近发现，醛糖还原酶抑制剂有很强的抗炎活性，甚至是在血糖正常的情况下。
总之，DM所导致的许多视网膜缺陷与视网膜组织中的炎症反应是一致的。上述许多炎性蛋白参与了DM患者视网膜病变的发病过程，其作用多是通过NF-κB活性的调节。大量研究显示，这些蛋白并非独立导致了视网膜的改变，而是以一种有序的，逐级的方式。DM动物的视网膜组织或视网膜被孵育在高糖环境下发现：①PARP调节NF-κB的活性，同时也影响ICAM-1的表达；②水杨酸盐在抑制NF-κB的同时，也抑制了iNOS、 ICAM-1、 VCAM、 COX-2的表达；③抑制iNOS也同时抑制了高糖诱导的前列腺素的产生；④抑制COX也抑制了ICAM-1的表达和白细胞的增多。说明这些通路之间是非常复杂，相互关联的。许多细胞因子能够激活NF-κB和其它一些促炎介质，促炎通路的调节和起始是十分复杂的。
2.5 细胞因子的分类及作用
细胞因子是一类能在细胞间传递信息的蛋白质或小分子多肽，其主要有免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如血管内皮细胞产生。细胞因子必须与靶细胞表面的特异性受体结合才能发挥其生物学效应。细胞因子受体/细胞因子的亲和力远高于抗原/抗体或MHC-抗原多肽的亲和力，所以极其微量的细胞因子（pmol/L）即可发挥明显的生物学效应。细胞因子可介导和调节免疫应答，炎症反应或作为生长因子，促进靶细胞增生，分化，并刺激造血，促进组织修复等。
2.5.1细胞因子分类及功能
在免疫调节和炎症反应中起作用的细胞因子主要包括以下几种：
(一) 白细胞介素（Interleukins，ILs）
白细胞介素（Interleukins，ILs）简称白介素，指一组由多种细胞产生的可介导白细胞或免疫细胞间相互作用，发挥免疫调节作用的细胞因子。国际免疫学会目前公布的白介素已有33种（IL-1～IL-33），分别介导、调节天然免疫和适应性免疫。
IL-1 家族也被称为免疫球蛋白家族，拥有和免疫球蛋白类似的结构。这个家族主要包括4个成员：IL-1α，IL-1β，IL-18，IL-1Ra，IL-1（IL-1α和IL-1β，合称为IL-1）是潜在的特异性受体拮抗剂。
(二) 干扰素（Interferous）
干扰素（Interferous，IFNs）是一类由病毒感染细胞或活化T细胞分泌的，具有抑制病毒复制和调节免疫应答作用的糖蛋白。根据细胞来源，理化性质和免疫原性的不同可分为IFN-α，IFN-β，IFN-γ三种类型。其中，IFN-α，IFN-β又称为Ⅰ型干扰素，与Ⅰ型受体结合；IFN-γ又称为Ⅱ型干扰素，与Ⅱ型受体结合。
I型IFN主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染细胞产生，其生物学作用包括：①抗病毒作用：I型IFN具有广谱抗病毒作用，可通过诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白抑制病毒在细胞内的复制，也可通过增强NK细胞、巨噬细胞、CTL细胞的活性杀伤病毒感染细胞；②抑制细胞分裂：I型IFN通过下调原癌基因c-myc、c-fos及生长因子的表达而使成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞和造血细胞停滞于G0/G1期，不能分裂增殖；③抗肿瘤作用：I型IFN具有抗肿瘤作用，即可以直接抑制肿瘤细胞的生长，也可以通过增强MHCI类分子的表达，增强淋巴细胞对肿瘤细胞的识别及应答；抑制肿瘤新生血管的形成，阻断肿瘤血供；④免疫调节作用。
Ⅱ型干扰素（IFN-γ）由两个亚单位构成，由Th1细胞和几乎所有CD +8T细胞产生，IL-2和IL-12可增强其转录。另外NK细胞也可产生IFN-γ。IFN-γ的抗病毒作用较弱，主要是免疫调节和抗肿瘤作用。①IFN-γ是单核吞噬细胞潜在的激活因子，它直接诱发多种酶的合成，充分激活巨噬细胞杀灭吞入的微生物；②IFN-γ增加MHCI类分子的表达，促进T细胞对肿瘤抗原的识别，增强细胞和体液免疫；③IFN-γ是NK细胞强有力的激活因子。
(三) 肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factors，TNF）
肿瘤坏死因子分为TNF-α和TNF-β两种，TNF-α主要来源于脂多糖激活的单核吞噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞及LAK细胞；TNF-β又称为淋巴毒素，主要由活化的Th1细胞产生，Th2细胞不产生。两种TNF的生物学功能相似。TNF参与机体的防御反应，是重要的促炎因子和免疫调节因子，其局部生物学活性包括：①对肿瘤细胞和病毒感染细胞具有生长抑制或细胞毒作用；②激活中性粒细胞，增强吞噬灭菌功能。刺激Mo/Mф合成IL-1、IL-6、IL-8和TNF，促进炎症反应；③增强T细胞、B细胞对抗原和丝裂原刺激的增殖反应；④抗病毒作用，增强MHCI类分子的表达，增强CTL介导的细胞毒作用。
(四) 集落刺激因子(Colony-stimulating factors,CSF)
集落刺激因子(Colony-stimulating factors,CSF)指具有刺激骨髓前体细胞生长和分化作用的因子，因其可刺激多能造血干细胞和处于不同分化成熟阶段的造血祖细胞生长分化，并在半固体培养基中形成集落而得名。不同的CSF在不同的成熟阶段作用于骨髓细胞并有选择性地促进不同种类谱系集落的生长。
①粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Stimulating Factor，G-CSF）：由激活的T细胞、单核吞噬细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞产生，主要刺激粒细胞的分化与成熟。
②粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor， GM-CSF）：是由激活的T细胞，单核吞噬细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞产生的，主要刺激骨髓干细胞向单个核细胞，包括数突状细胞分化，也可促进白细胞、血小板、红细胞等祖细胞的生长，GM-CSF还可刺激成熟的白细胞。
③单核细胞集落刺激因子（Monocyte Colony Stimulating Factor，M-CSF）：也称CSF-1，由吞噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生，主要作用于单核细胞的祖细胞，促进其分化成熟。(五) 转化生长因子（Transforming Growth Factors-β，TGF-β）
TGF-β是这个家族的原始成员，但仍有至少50种蛋白被划归为TGF-β成员，其中包括活化素、抑制素、骨形成蛋白、胶质细胞源性神经营养因子等。TNF家族的受体有一些特征性的结构：胞外段有一个富含半胱氨酸的结构域；激酶部位；GS部位；富含丝氨酸/苏氨酸的尾部（2型受体）。TGF-β家族具有许多功能，包括神经元存活的调节，修复过程的建立，以及抗炎活性。
(六) 生长因子家族
生长因子包括许多家族，每一个多有独特的功能。一个家族包括VEGF和血小板源性生长因子（Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)，他们是潜在的细胞有丝分裂促进因子和血管生成因子，在胚胎发育，伤口愈合，血脑屏障的完整性上扮演着重要的角色。上皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）家族包括EGF、神经生长调节因子、双调蛋白、β细胞调节素。EGF家族成员调节着外胚层和中胚层来源细胞的生长和增生。胰岛素样生长因子-1，II（Insulin-like Growth Factor, IGF-I和IGF-II）属于胰岛素样生长因子家族，结构上与胰岛素原具有同源性。IGF-1在所有的细胞类型和组织中均是高表达的，具有比胰岛素更高的促生长活性。IGF- II主要在胚胎组织中表达，与发育有关。成纤维细胞生长因子（Fibroblast Growth Factor，FGF)是另一组细胞因子，主要与细胞增生、生长和分化等方面有关。他们作用在不同细胞类型上调节血管生长，胚胎发育，代谢调节，细胞迁移，神经营养作用和组织修复等。
(七) 趋化性细胞因子(Chemokines)
趋化性细胞因子是一类结构同源，相对分子质量约为8X103～9X103的一组具有趋化作用的细胞因子。大约有50种人类趋化因子。所有趋化性细胞因子的结构内部都有二硫键。
趋化性细胞因子的细胞来源主要包括：①抗原激活的T细胞；②LPS或细胞因子激活的单核吞噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞；③血小板。总的来说，趋化因子有两个主要的作用：维持体内的平衡和诱导炎症反应。趋化因子的平衡作用主要涉及造血过程中免疫监视和免疫导航作用，这些趋化因子是持续表达的；炎性趋化因子是在炎症状态下或炎性刺激以后产生的，以先天性和后天性免疫细胞为作用靶点，促进免疫反应。另外，趋化因子还有其它一些生物学活性，例如，趋化性细胞因子与T细胞表面的相应受体结合后，参与调节Th1、Th2细胞的分化。
趋化因子的活性通过结合到一个七个跨膜G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors ，GPCR)上而调节。趋化因子受体根据受体结合部位N-末端保守的半胱氨酸位点的数量和位置而分为4个家族。带有两个半胱氨酸位点并且被一个氨基酸隔开的受体被称为α-趋化因子受体（如CXCR2 和CXCR4)；带有两个半胱氨酸位点，其间无氨基酸相间的受体称为β-趋化因子受体（如CCR5, CCR4, CCR3 and CCR2)；γ-趋化因子仅有一个半胱氨酸位点（XCR1)；δ-趋化因子受体由3个氨基酸分开两个半胱氨酸位点(CX3CR1)。被一个配体刺激后，GPCR发生构型的改变，通过GDP→GTP的转换，激活G-蛋白，伴随着非偶联的G-蛋白脱离。一旦激活，G-蛋白即触发了一系列信号传导通路，调节着各种细胞的功能。
①CXC趋化因子
趋化因子根据毗连CXC部位的三个氨基酸序列的出现或缺乏分为两组：Glu-Leu-Arg位点组成了ELR结构，如果这个结构存在的话，这类CXC趋化因子被称为ELR(+)[115]。ELR(+)趋化因子的主要功能是趋化中性粒细胞和促进血管生成。这组趋化因子包括：CXCL1、CXCL2、CXCL3、 CXCL5、 CXCL6、CXCL7、 CXCL8和CXCL15。这些细胞因子主要通过CXCR1 和 CXCR2受体趋化白细胞。对比之下，ELR(−)趋化因子主要吸引淋巴细胞和单核细胞，而对中性粒细胞具有较低的亲和力。这组细胞因子包括：CXCL4、 CXCL9、 CXCL10、 CXCL11、 CXCL12、 CXCL13、 CXCL14 和 CXCL16，他们具有很多活性，但总的来说主要是抗血管生成和趋化单核细胞。目前研究最清楚的CXC趋化因子是IL-8（CXCL8)，它的功能是吸引多形核细胞到急性炎症部位。
②CC趋化因子
CC趋化因子主要针对单核细胞，作用是维持体内平衡和炎症反应。这个家族根据其功能的不同可分为：致敏，致炎，调节发育的和平衡的因子。这些与发育和平衡相关的因子，正如预料的，是持续产生的，而其他一些趋化因子是由一些特异信号所诱导产生。与致敏有关的CC趋化因子主要针对噬酸性粒细胞、噬碱性粒细胞、肥大细胞，是促进组胺释放的潜在趋化剂和刺激剂。炎性趋化因子也是可以诱导的，通过募集各种效应细胞而扩大炎症反应。目前研究最多的CC趋化因子是MCP-1。
③CX3CL1
CX3CL1或称不规则趋化蛋白(Fractalkine, FKN)是CX3C亚家族的一个独立成员，在第1，2个半胱氨酸位点之间带有3个氨基酸干预位点。FKN，是CX3CR1的配体，由373个氨基酸组成，在许多组织，包括肝脏、小肠、肾脏和大脑中均有表达。FKN的结构特点是：N-端是包含76个氨基酸的趋化部位，对于靶细胞的结合、黏附和激活是十分重要的[116-117]。FKN还有一个18个氨基酸的疏水口袋，横跨细胞膜。延伸的羧基末端使他锚到细胞表面。
④XCL1
趋化因子家族的最后一个成员是XCL1，即淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)，也是C家族的唯一代表。这类趋化因子主要针对CD4 +和 CD8 +淋巴细胞，但不针对单核细胞。他们结合到一个独特的受体XCR1上。虽然与CCL3和 CCL8有一些同源性，但XCL1缺乏CC和CXC趋化因子家族典型的第1，3个半胱氨酸位点。各类趋化因子的受体及功能概括在表2。中。
表2. 趋化因子及其受体
类 名称 受体 产生细胞 功能
C Lymphotactin  T细胞 淋巴细胞移行
CC MIP-1α CCR1，3，5 单核细胞
T细胞
肥大细胞
成纤维细胞 和HIV竞争结合受体
抗病毒
促进Th1反应
MIP-1β CCR1，3，5 单核细胞
巨噬细胞
中性粒细胞
内皮细胞 和HIV-1竞争结合受体
MCP-1 CCR2B 单核细胞
巨噬细胞
成纤维细胞
角化细胞 刺激巨噬细胞
刺激噬硷性细胞释放
组胺
促进Th2细胞
RANTES CCR1，3，5 T细胞
血小板
内皮细胞 刺激噬硷性细胞脱颗粒
激活T细胞
CXC IL-8 CXCR1
CXCR2 单核细胞
巨噬细胞
成纤维细胞
角化细胞
内皮细胞 趋化激活中性粒细胞
刺激血管生成
IP-10  
CXXXC Franctal-kine  单核细胞
内皮细胞 内皮细胞和白细胞的黏附
2..5.2 细胞因子的检测方法
细胞因子的检测方法一般分为免疫学、生物学及分子生物学测定三大类：
(一) 生物活性检测
生物学测定法的原理是根据细胞因子依赖性细胞株(即靶细胞)的促增长作用，以增殖细胞中的DNA合成酶活性为指标，间接推算出细胞因子的活性单位。本法是使用最早的方法，需培养特定的靶细胞株或依赖株，手段繁琐，检测费时。
(二) 免疫学检测法
几乎所有的细胞因子都可以用ELISA（双抗体夹心法）进行检测，包被抗体和酶标抗体可以是抗两种不同表位的单克隆抗体，或包被抗体用单克隆抗体而酶标抗体用多克隆抗体。包被的单克隆抗体保证检测的特异性，酶标单克隆抗体保证检测的灵敏性。
(三) 分子生物学测定法
此法是近几年来引用的新技术，已问世的方法有RNA印迹法，核酸酶保护分析，原位
杂交和聚合酶裢反应。其原理都是通过检测相应mRNA量来推算细胞因子的有无或多少。
(四) 多元磁珠免疫测定法（Multiplex Bead array assay）
因分子杂交检测法及生物活性检测法所需的实验条件要求较高，目前多数采用免疫直接定量法（ELISA）测定细胞因子，ELISA法每次测得一种细胞因子，操作简单，经济。但因细胞因子之间往往具有协同作用或抑制作用，即细胞因子之间具有网络关系，因此，检测单一细胞因子常常不能完全阐述疾病的演变关系，而若检测多种细胞因子，则使用标本较多，耗时，价格昂贵，且需多次重复操作，同时,各种细胞因子试剂盒标准品的产地，生产日期不具有可比性，因此常会使导致实验结果出现偏椅。多磁珠免疫测定法（Multiplex bead immunoassay）是近几年来出现的一种新免疫学技术，与传统的ELISA 方法相比，它能够同时测定一个样本中的多种细胞因子浓度，有助于对细胞因子网络之间的研究；另外，它具有更高的敏感性、特异性，因此，有助于对一些样本，如泪液，唾液和尿液等中低丰度细胞因子的检测。该方法将细胞因子捕获在一系列荧光微球上，通过荧光标记的检测抗体在流式细胞仪上进行检测。该仪器通过两种激光激发微球和荧光发光集团，另外，通过数字信号处理器将成千上万的信号压缩成可处理的数据输出。该方法现已用于血清，泪液和尿液等样本中多种细胞因子的检测[95,118-122]，其精确性高、可重复性好，具有其他实验方法无法比拟的精确度和灵敏度。
2.6 AGE与糖尿病眼部病变
糖基化是一种常见的蛋白质转录后修饰方式，高血糖引起的高级糖基化在DM微血管并发症形成和发展过程中扮演着非常重要的角色。AGE和/或其受体在组织中的靶向聚积，与DM患者终末器官的损害密切相关。
2.6.1 AGE的来源与特点
AGE是在非酶促条件下，由还原糖的醛基与蛋白质、氨基酸、脂类或核酸等大分子物质的游离氨基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰后产生的一组稳定的终末产物。该反应早在1912年就被法国化学家Maillard 发现，故又称Maillard 反应。在反应早期，蛋白质的氨基与还原糖的醛基缩合成一不稳定的Schiff 碱，该过程需时很短，而且是一可逆过程，然后由Schiff 碱经过环化、异构化重排形成醛胺类产物，即Amadori产物；Amadori产物再经过氧化、降解、脱水、重排产生醛类 、双碳化合物、还原酮类等中间产物，这些中间产物可进一步聚合或再与氨基酸、核酸反应形成AGE。
目前，人们己知的AGE结构形式有：羧甲基赖氨酸 (Carboxymethyl Lysine, CML)、羧乙基赖氨酸(Carboxyethyl Lysine,CEL)、羧甲基缬氨酸(Carboxymethylvaline,CMV) 、精氨嘧啶、戊糖苷素、吡咯素、羧甲基鸟嘌呤(Carboxymethyl Guanine, CEG), N- 4 -羧基- 4,6 -二甲基- 5,6-二羟基 – 1,4,5,6-四氢嘧啶-2 -基鸟氨酸 [N - (4 - carboxy - 4 ,6 - dimethyl - 5 ,6 - dihydroxy - 1 ,4 ,5 ,6 - tetrahydropyrimidin - 2 - ylomithine ), THP]、果糖酰赖氨酸、咪唑酮以及二赖氨酰咪唑啉衍生物: 甲基乙二醛-赖氨酸衍生二聚体(Methylglyoxal-Derived Lysine Dimer, MOLD)、乙二醛-赖氨酸衍生二聚体(Glyoxal-Derived Lysine Dimer,GOLD)、3-脱氧葡糖醛酮-赖氨酸衍生二聚体(3-Deoxyglucosone - Derived Lysine Dimer, DOLD) 等。
AGE有独特的生化特性：①它呈棕色；②一部分AGE具有特有的荧光特性；如戊糖苷素，因此可以通过组织和血浆中存在的荧光来检测它们的存在。③具有交联性，即使去除了糖，它们之间仍能通过侧链交联，形成分子量极大的物质；④对酶稳定，不易被降解；⑤许多细胞，如巨噬细胞、系膜细胞、内皮细胞表面均有其受体，AGE通过这些受体可以影响细胞的功能。
除了内源性形成的AGE，AGE也可以来源于外界，如烟草或饮食。食物的加工过程，特别是加热时间过长，可以促进糖氧化和/或脂氧化产物的产生。吸烟者和高AGE饮食者组织和循环中AGE水平增高，同时伴随着炎性标志物水平的增高。动物实验表明，暴露于高水平外源性AGE后，可引起视网膜和肾损害，然而，这些外源性AGE在DM并发症发生过程中的相对重要性目前尚不清楚。
AGE在生理状况下即稳定形成，但是机体有许多复杂的受体系统参与清除衰老的、糖基化改变的分子和/或降解组织中已经存在的AGE交联体。几种AGE受体（Advanced Glycation End Products- Receptor，AGE-R）分子已经被描述，诸如RAGE、AGE-R1、AGE-R2、、AGE-R3、半乳糖结合蛋白-3（Galectin-3）、CD36和Ⅰ、Ⅱ型清道夫受体等。目前认为AGE - R1、AGE - R2、AGE - R3 是作为AGE-R复合体存在，与AGE的转化和降解有关[123]；RAGE为最具特征性的AGE–R，RAGE作为信号转导受体介导AGE结合在细胞表面，激活多个信号转导通路，导致多种细胞因子的合成与释放，促进血管病变的发展[124]。
2.6.2 与AGE有关的糖尿病眼部改变
2.6.2.1 角膜的改变
有证据表明，Maillard反应产物在DM、衰老相关性眼病中扮演着非常重要的角色。例如，DM和衰老可以造成角膜中蛋白结构的改变，以角膜基质、后弹性层/包曼氏囊变厚、角膜水肿、内皮层和上皮层形态学的改变为主要特征[125-126]，上述改变导致角膜基质蛋白稳定性下降，AGE免疫活性增加，研究证实DM患者角膜上CML和戊糖苷素浓度显著增加[127--128]。包曼氏膜对Maillard反应非常易感，DM患者的包曼氏膜被严重糖化。在体外，AGE修饰的蛋白通过整合素/非整合素（integrin/non-integrin）受体-基质结合作用可显著减弱角膜上皮细胞的黏附能力[129]。当角膜上皮细胞暴露于AGE后出现了凋亡反应，同时RAGE和galectin-3的表达增加[130]，但是这些受体在角膜疾病中的作用尚不清楚。
与AGE沉积在一些组织的细胞外基质蛋白上类似，AGE也出现在衰老的角膜上。最近，Kessel和同事所作的流行病学研究发现，与糖基化相关的荧光出现在抽烟者和血糖控制较差的DM患者的角膜上，这些糖基化造成的交联大多数出现在角膜（基质和薄层）的胶原蛋白上，而这种改变可以通过阿司匹林类镇痛剂（有抗糖化的作用）有效地逆转[131]。
2.6.2.2 晶状体的改变
白内障的形成是全球造成视力损害的主要原因之一，造成晶状体浑浊的原因有很多，其中衰老是最主要的危险因子。Maillard 反应在白内障形成中的作用已经被广泛研究。DM患者和衰老者晶状体中各种AGE显著增加。与年龄相关的糖基化造成了晶状体纤维蛋白膜完整性的改变，以及蛋白质三级结构的变化，引起晶状体蛋白的聚合和共价交联。不论白内障是如何形成的，均可造成远视眼可调性下降。双碳基复合物，如乙二醛、甲基乙二醛在DM患者和衰老者晶状体中增加，引起晶状体蛋白的交联和蛋白活性的丧失，αβ晶状体蛋白增加，密集的聚合物形成[132-133]。DM患者比非DM患者形成AGE的速度更快，AGE抑制剂复合物可以有效地阻止DM相关性白内障的发生。很明显，AGE是白内障形成的一个重要危险因素。实际上，由金属催化的Fenton 反应（经常形成羟基）是白内障形成的重要病理生理机制，DM患者AGE在晶状体蛋白上的形成增多，致具有氧化还原活性的铜在晶状体细胞上的聚集显著增加，催化了维生素C的氧化。最近的研究表明在与衰老相关的白内障的形成过程中，糖基化终末产物、金属离子、自由基之间存在紧密的联系[134]。
2.6.2.3 玻璃体的改变
眼睛的后部充满了透明的玻璃体凝胶，由具有交联特性的胶原蛋白（II,V/IX, and XI）纤维和亲水性的葡萄糖胺聚糖透明质酸组成。玻璃体病多以胶原成分的形态学改变为特征，年龄相关性玻璃体退形性改变通常是由于胶原和透明质酸的分离，造成了玻璃体结构的改变，例如玻璃体的溶解和后玻璃体脱离。对DM患者，这些改变发生更早，有时称为玻璃体病。
玻璃体退形性改变的分子基础目前仍不清楚，研究显示，糖基化诱导了玻璃体胶原纤维之间的异常交联，导致了胶原脱离透明质酸，以及凝胶稳定性的改变。而且，人类玻璃体中的AGE水平与年龄相关。DM患者玻璃体液中AGE水平显著升高。体外研究发现，将玻璃体孵育在25 mM的葡萄糖中，具有免疫活性的AGE可在玻璃体胶原成分上形成，造成了纤维的交联，此过程可被AGE抑制剂-氨基胍显著抑制[135]。Sebag将糖尿病患者玻璃体的退形性改变称为“早熟的衰老” [136]。当然其他一些非糖基化的生理学和生化学机制可能也参与了玻璃体的退形性改变，但是AGE似乎在DM和年龄相关性玻璃体功能紊乱中扮演着更加重要的角色。
2.6.2.4 AGE与糖尿病视网膜病变
临床研究显示DM患者血清、皮肤、角膜中AGE的水平与DR的发生和严重程度密切相关[137-140]。与无糖尿病症状的同龄人相比，AGE水平在背景期或增殖前期青春期前DM儿童和青少年患者是显著增加的。虽然许多研究仅测定了一些不确定的AGE部分，然而一些非常确定的AGE物质，比如CML、戊糖苷素、交连素在DR患者显著增加。然而，有些研究并未发现AGE水平和DM患者视网膜病变之间的联系。虽然这些研究存在明显的不一致，可能是由于DM人群的不同和/或血浆中AGE的定量尚无统一的方法。AGE和/或Amadori 产物存在于DM患者视网膜血管和神经胶质内，他们对于细胞功能有显著的损害作用[141-142]。体内和体外研究显示DM患者增高的AGE水平在视网膜病变的发生和进展中是一个重要的因素。
在实验性糖尿病动物模型中，AGE在视网膜周细胞上堆积会对细胞的功能和生存产生有害影响，与视网膜微血管内皮相比，视网膜周细胞具有很低的复制能力。AGE对视网膜周细胞是有毒的，会造成周细胞功能的紊乱，如磷脂水解作用和磷脂酶抑制作用的异常；过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的改变等，其作用可能是通过AGE-受体介导的。最近的研究表明，这些物质可能诱导成骨细胞的分化和周细胞钙化[143]，这些是细胞调亡和死亡的主要反映。在体内，视网膜周细胞被血管基底膜所包围，存在于血-视网膜屏障之外。通过体外研究发现视网膜周细胞生长在类似于DM患者体内的AGE修饰的基底膜上时，周细胞出现了功能紊乱和调亡死亡，而这些改变可以通过将PDGF-BB转移至基质中而获得挽救[144]。
体外和体内研究显示视网膜细胞暴露于AGE是造成血管内皮生长因子表达上调的重要因子，VEGF不仅在PDR中促进新生血管的形成，在视网膜微血管系统中它也是一个强有力的血管通透因子，在血-视网膜屏障功能紊乱上扮演着角色[145-146]。血管通透性增加是DR的一个重要病理生理标志。有证据表明，AGE在轻、中度血-视网膜屏障的破坏中扮演着非常重要的作用。当给非糖尿病大鼠体内注入AGE修饰蛋白后，血-视网膜屏障功能完整丧失，视网膜微血管内皮细胞表面的黏附分子，如ICAM-1的水平增加，同时白细胞变厚，可变形性减低。提示对于DR患者，AGE可导致促炎症反应通路的激活，这些改变促进了白细胞黏附到内皮细胞上，造成毛细血管的阻塞和血管细胞的死亡。
总之，AGE导致DR的发病机制可能与以下因素有关：①血管舒缩调节功能异常：AGE形成于血管壁基质蛋白后，能通过灭活NO内源性血管舒张因子而影响血管舒张反应，同时AGE能够促进血管收缩剂即内皮素-1在体内的表达。AGE的形成打破了正常血管舒缩调节功能的平衡，使血管易于痉挛，加重组织缺血、缺氧，促进血栓形成；②被糖基化修饰的胶原蛋白对胶原酶的稳定性增加，降解减慢，血管基质合成增加，管腔变窄；③毛细血管通透性增加，血浆渗漏；④巨噬细胞被趋化激活，分泌IL-1 、TNF、IGF-IA、PDGF等，引起血管壁内平滑肌细胞、成纤维维细胞等增殖；⑤血液动力学、血液流变学异常；⑥血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1)的过度表达,导致单核细胞的趋化、激活、迁徙；⑦GE与其细胞上受体结合，导致细胞氧化防御机制的耗竭和氧自由基的生成，从而激活转录因子NF-κB，后者诱导组织因子的表达和VCAM-1分泌增加。
2.6.3 AGE的测定方法
由于AGE化学结构不明和多样性，因此检测血清和组织中的AGE水平目前尚十分困难，目前尚无现成的商品试剂盒可得。常用的检测AGE方法有：
(一) 放射免疫分析
通过与同位素标记抗原竞争结合特异抗体而达到检测样品中某种特殊AGE的目的，该方法灵敏度较高，但标记抗原的同位素放射强度随时间衰减。造成检测结果的批间差异较大，重复性不好。
(二) 放射受体分析
AGE特异结合受体存在于许多细胞表面，故可通过放射受体分析法来检测AGE水平。该方法敏感性、特异性和精确性均较高，但由于其操作需培养细胞，耗时费力，而且，结果受同位素衰变影响大，稳定性和重复性差，检测时须使用较大量放射性同位素，易造成环境污染，故很难推广应用。
(三) 免疫组织化学法
免疫组织化学法是利用对组织中AGE的分布进行定位检查。该法检测AGEs首先要获得组织标本。操作过程繁杂，且只能做定性检测，目前，免疫组织化学法主要用于AGE相关疾病发病机制的研究。
(四) ELISA法
用竞争性ELISA法检测血清和组织中AGE水平是目前最常用的方法。其基本原理是：固相抗原AGE与待测标本中AGE竞争地结合有限量的抗体，结合到固相上抗体的量与标本中AGE的量呈负相关。ELISA具有特异性高，精确性好，简单快速等优点。但目前AGE抗体的制备仍需要进一步的提高，另外尚无通用的AGE表示单位和绝对标准，这是目前使用竞争ELISA法检测AGE的最大限制。
(五) 荧光光谱法
由于一些AGE具有自发荧光的特性，因而可用测定其荧光值来反映AGE水平。用于测定AGE的激发波长为300～420 nm，发射波长为350～600 nm，文献报道不一。目前较为常用的是激发波长370 nm，发射波长440 nm。
(六) 色谱分析技术
本法是近年来发展起来的检测AGE技术。色谱法是将多种物质混合试样通过色谱分离场作用分离成单一物质成分进行检测确定的分析技术，由于AGE具有特定的电荷、分子量、化学性质以及物理性质，因此，可以利用色谱法将AGE与其他物质分离并进行定量分析。HPLC具有高效、高灵敏度、高分辨率的特点，在分析AGE的结构方面有其独到之处，目前HPLC已用于DM患者血清、尿液和晶状体蛋白中的精氨嘧啶、戊糖苷素的检测[148-151]。但该方法操作过程繁杂、耗费昂贵，且需要特殊的设备，因此限制了它的广泛使用。
2.6.4 蛋白质糖基化修饰的研究方法
糖基化蛋白组的研究是以蛋白质组学技术为基础, 并结合糖基和糖类的某些特点和特性对糖蛋白进行研究的一门新兴学科，其研究内容主要包括：首先确定糖蛋白的存在；其次是富集糖蛋白，即糖蛋白的分离纯化；继之鉴定糖基化氨基酸的位点和确定糖组成；最后进行糖蛋白功能的研究。目前糖基化蛋白组研究的相关技术有：
(一) 凝集素亲和技术
凝集素是一种从植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白，其能识别糖蛋白和糖肽中复杂的碳水化物结构, 且一种凝集素只能与一个或几个糖基特异性结合。如刀豆蛋白A (Concanavalin, ConA)能特异性结合D-半乳糖、D-甘露糖和N-乙酰葡糖胺单糖, 识别N-聚糖糖蛋白；麦芽凝集素(WGA)能与N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸特异性结合。凝集素亲和技术即利用某一凝集素能够特异性结合糖基的特性, 通过层析、透析和电洗脱等“糖基捕获”法获得特异性的糖蛋白质, 再联合蛋白质组技术对糖蛋白进行检测。Mawuenyega et al 就利用凝集素联合2DE-LC/MS/MS 对糖蛋白进行了检测[152]。Yang 等[153]则将ConA、WGA和木菠萝凝集素混合为多凝集素亲和柱，来分离纯化血清中多种糖蛋白，结果发现血清中50%的蛋白质被糖基化修饰。
（二）抗体标记法
抗体标记法是针对糖蛋白所带糖链的类型制备各种特异性抗体，对糖蛋白进行检测。Cieniewski-Bernard et al 通过抗O-GlcNac抗体鉴定了小鼠骨骼肌中的糖蛋白[154]。
(三) 电泳技术
由于糖蛋白所提供的量是有限的, 所以用1-DE或2-DE分离蛋白从而检测糖基化结构的变化受到了挑战。但是凝胶电泳技术作为蛋白质组学研究中最经典的技术, 具有简便、直观、易于比较的优势。所以在该技术的基础上，人们针对糖蛋白的一些特性，探索了一些优化方案。市场上出现了许多基于糖高碘酸盐氧化作用, 以及夹层抗体或生物素/链霉亲和素等显色方法发展起来的产品。随着荧光染色技术的发展, 在同一张胶上可顺序染上不同的荧光素, 通过荧光扫描仪可将磷酸化修饰的蛋白、糖基化修饰的蛋白和总蛋白分别显影并进行比较。Sihlbom et al通过对凝胶中糖蛋白和总蛋白同时荧光染色, 比较了阿尔茨海默病患者与正常对照2-DE的差异, 发现了较多表达差异的糖蛋白[155]。尽管通过2-DE和多重荧光染色来研究蛋白质翻译修饰的技术仍无法显示糖蛋白结构, 但该方法简单快速, 无需特别复杂的仪器，因此目前在蛋白质糖基化修饰的研究中仍占有重要地位。
(三) 生物质谱技术
生物质谱技术作为蛋白质组学研究的重要技术, 在蛋白质的糖基化修饰研究中也占有十分重要的地位。在糖蛋白中, 糖链一般处于蛋白质高级结构的外侧, 糖苷内切酶将糖链切除，将反应前后的质谱图进行比较, 就能直接表述糖链的质量。而通过凝集素直接提取被消化后糖蛋白的糖肽段, 再通过质谱技术及互联网上数据库检索系统, 可以直接分析糖蛋白中的寡糖链。
气相色谱质谱法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS)、高效液相色谱质谱法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS) 以及电喷雾质谱技术(Electrospray Ionization, ESI)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time- of - Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸电离飞行时间质谱技术（Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)等是目前蛋白质组学研究中最常用的质谱技术。
Karachalias et al[156]采用液相色谱-质谱(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry, LC/MS)分析DM大鼠和正常大鼠肾小球、视网膜、外周神经蛋白提取物以及血浆蛋白中果糖-精氨酸的水平和AGE位点，DM大鼠肾小球、视网膜、周围神经和血浆蛋白中果糖-精氨酸水平显著升高，肾小球、周围神经和血浆蛋白中CML、CEL浓度增加，视网膜CML浓度也增高。从甘油醛、甲基甘油醛和3-脱氧葡萄糖酮醛获得的脱氢咪唑酮AGE在视网膜、肾小球、神经和血浆蛋白中增高。MALDI-TOF-MS应用性能好、灵敏度高，可直接测定分子质量不大、糖链不十分复杂的糖蛋白。Kislinger 等用MALDI-TOF-MS检测Amadori产物、CML 和眯哗酮A，将AGE- Lysozyme 通过蛋白内切酶Glu-C 酶切，用MALDI-TOF-MS检测，获得质量指纹谱，与蛋白数据库比较后，可以获知蛋白质的糖基化位点。MALDI - TOF – MS虽然不能做绝对定量分析，仅能做相对量化分析，但在分析分子质量方面有独特的优势，而且还可以同时分析几种不同的AGE。Lapolla et al[157]采用MALDI-MS方法分析健康人，血糖控制良好的DM患者、血糖控制较差的DM患者血清中IgG的糖基化，结果显示，DM患者IgG非酶糖基化程度显著增加，血糖控制良好者在512-1565Da，血糖控制较差者其达到了827-4270 Da。IgG上糖分子的数目，健康者波动于1-5，血糖控制良好者5-9，血糖控制较差者10-25。大多数糖基化位点存在于IgG的Fab段，因此，DM患者的免疫缺陷可能与Fab段糖基化，抑制了抗原和抗体的分子识别过程有关。
血液是体液蛋白质组学研究中最为常用的一种，但是血清含有大量的高丰度蛋白，诸如白蛋白、IgG，有可能掩盖一些低丰度蛋白，造成低丰度蛋白的检出率降低。最近，虽然出现了一些新技术来清除这些高丰度蛋白，然而伴随着这些高丰度蛋白的清除，其他一些不希望清除的蛋白质，甚至是疾病的重要标志物也可能会同时被清除。因此有学者提出克服这些缺点的策略之一是选择最接近病变部位的其它一些体液，比如DR患者可选择泪液、晶状体、玻璃体液等进行研究。Patel et al[158]对DR患者玻璃体液采用蛋白质组学研究发现，VEGF水平增高，色素上皮细胞源性因子水平降低。Yamane K et al[159]对PDR患者血清和玻璃体液中的蛋白质组成进行了对比分析，发现了3中血清中不存在的蛋白质：色素上皮细胞源性因子，前列腺素-D2合成酶，视网膜样感光器间结合蛋白。
2.6 泪液在研究中的应用价值
2.6.1 泪液学的研究进展
泪液是主要由泪腺分泌的一种水样液体, 通过瞬目运动覆盖在眼表面形成泪膜。通过睑的瞬目和泪河的泪流散布于眼表面，在睑裂部形成由粘液层、浆液层和脂质层组成的泪膜。浆液层占全泪膜厚度的95％以上，约7-8μm厚；表面的脂质层厚约0.1-0.2 μm，最内是粘液层，约0.3μm厚。因它牢固的吸附于上皮，而且起着泪膜形成和稳定的关键作用。曾一度被视为角膜的一部份。泪液主要是由泪腺的腺泡细胞分泌。泪液的主要功能有：为光折射提供一个光平面；润滑眼睑、结膜、角膜；为角膜提供营养；清除结膜和角膜异物；使白细胞易于接近结膜和角膜；通过特异性和非特异性抗菌物质，保护眼睛免受病原微生物的侵害。
自从本世纪20年代发现了泪糖和溶菌酶以来，泪液实验研究逐渐增多。近30年左右，特别是近几年，由于分析方法的进步，如分子生物学方法的应用，泪液组成成份有了更多的发现。目前发现泪液由多种蛋白质、脂类、碳水化合物、粘液、电解质和其它一些小分子代谢物组成，同时EGF、TGF-β和FGF也可由泪腺产生而存在于泪液中；另外，雄、雌性激素也可由泪腺产生，泪腺均存在其受体。泪腺也可产生一种淋巴增生因子，分子量约为65kDa，与局部免疫反应发生有关。泪液中的蛋白质含量大约是6-10mg/ml，常见的几种泪液蛋白是：溶菌酶、乳铁蛋白、分泌型IgA、白蛋白和脂质运载蛋白等。最近报道在正常人的基础泪液中发现了大约500多种蛋白质[160]。泪液可以通过HPLC，2-DE、MS等技术分析，有人已经建立了正常人泪液的蛋白质图谱[161]。
    泪液学是眼科学中发展最缓慢的分支之一，其所以落后，除了泪器深埋于组织内、伤病较少见，泪器疾病多数不会立即影响视力和生命等原因以外，主要是泪腺的解剖不全。基础泪腺散布于结膜和眼睑，难与反射泪腺共同构成泪器系统。70年代以前，泪液学的发展主要集中在泪器解剖上。近20年来泪液学的实验研究才有了迅速发展。我国西南大学张汗承教授于1988年成立了全国泪液协作组，美国Holly也在1987年创建了国际泪液学学会，意大利Miglior在1988年创建了欧洲泪液学学会。泪液学逐渐开始向专科化迈进。
2.6.2 糖尿病患者泪膜和眼表面的改变
泪液中的成分不仅会受角膜炎、干眼症等眼部疾病所影响，一些系统性疾病，如DM、肿瘤也会影响泪液的成分。研究发现DM患者血糖水平达到20mmol/l时会引起泪液中糖水平的相应升高[162]；体外研究显示眼表面的AGE水平会随着糖浓度的升高而增加。Grus et al [163]等采用HPLC研究糖尿病干眼症患者、非糖尿病干眼症患者、健康者泪液中的蛋白质组成，发现三组具有显著性差异。Herber et al [164]通过2-DE分析发现DM患者泪液蛋白的组成与非DM对照者有显著差异。
DM可引起眼表面的改变，特别是干眼症是最常见的临床表现之一。这些患者常常出现各种角膜并发症，如条状角膜炎、营养不良性溃疡和持续性上皮缺陷[165-166]。干眼是这些疾病的主要原因，干眼的机制还不十分清楚，但自主神经功能失调可能是主要的原因之一。另外，AR，山犁醇通路的第一个酶也与此有关。研究发现口服AR抑制剂能够显著提高泪液动力学。有人已发现HbA1C和干眼综合征之间存在相关性，HbA1C的水平越高，干眼综合征的发病率就越高[167]。另一些研究发现DM患者与健康对照者相比，泪液的分泌量和泪膜破裂时间测试（tear break up time test ，TBUT)降低[168-169]。这些研究表明，对于DM患者，TBUT应列为一个常规眼科检查项目。干眼可导致视力缺陷，角膜疤痕和穿孔，以及继发细菌感染等。如果这些综合征能够得到早期诊断和治疗，就会阻止其他眼部并发症的出现。
DM可引起角膜内皮细胞结构和厚度的变化。许多临床证据显示DM患者角膜自体荧光增强，角膜基底膜增厚，内皮细胞的密度和六角型细胞的百分比降低，细胞大小的变异系数增大，DM病程10年以上者，角膜中度增厚，细胞大小的变异系数显著增加，而细胞密度和六角形细胞显著降低，特别是角膜中心厚度与DM病程显著相关[170-171]。Saito et al 报道DM患者角膜敏感性和泪液的分泌总量显著降低，而且，角膜敏感性降低的程度与DR病变的严重程度密切相关[172]。角膜是机体最敏感的组织之一。角膜感觉神经在角膜上皮的维持和治愈中扮演着重要的角色。临床研究发现三叉神经的损害经常导致神经营养性角膜病变。神经病变是DM的另一个突出并发症。糖尿病角膜病也可视为糖尿病多神经病变的一个特征。
DM可导致角膜上皮屏障功能的破坏，而且与DM的病程、视网膜病变的严重程度、HbA1c水平密切相关 [173-174]。研究发现DM患者角膜上皮基底膜上有AGE堆积，而且是角膜上皮病变的主要原因。HbA1c水平与角膜上皮细胞对荧光的通透力显著相关。因为HbA1c是血红蛋白的一个早期糖基化产物，它与AGE的形成密切相关。体外研究也显示非酶糖基化的层粘蛋白堆积在培养皿上可导致角膜上皮细胞的黏附力和传播能力降低[175]。概括起来，AGE在角膜上皮基底膜聚集可能损害角膜上皮的生理结构，导致角膜上皮屏障功能的下降。
总之，DM患者角膜的变化可以涉及每一层，包括角膜上皮细胞数量的减少和基底膜的改变，上皮黏附功能的改变和上皮屏障功能的降低。同时，DM也可导致泪液的数量和质量发生特征性改变。
最近几年，虽然在识别新的AGE结构方面，以及细胞对AGE刺激的反应方面取得了一些研究进展，然而对疾病状态和非疾病状态下不同的蛋白质是否对糖基化修饰具有不同的易感性，以及糖基化修饰对一种特殊蛋白所产生的直接影响仍不清楚。Schmitt et al通过蛋白质组学技术发现白蛋白、Ig-kappa 链、前列腺素D2合成酶、溶菌酶C和β2-MG是DM患者血滤液中几种主要的被CML修饰的蛋白质。DM患者与非DM患者泪液的蛋白质组成具有显著差异。但是截止目前为止对于DR患者泪液中糖基化修饰蛋白的研究仍属空白。
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