本文是一篇医学论文，本实验通过磺化和水热反应在PEEK表面制备了多孔结构，然后利用简单的溶剂挥发法将抗菌肽HHC36加载于其表面，并对其进行表征分析以及体外和体内的抗菌性能和生物安全性评价，以期为拓展PEEK基骨科植入物的应用提供理论基础。
第1章引言
1.1研究背景
随着创伤、关节退化和骨肿瘤发生率的增加，越来越多的骨科植入物被应用于骨科手术中，如椎间融合器、人工关节置换和骨折固定装置[1]。这些骨科植入物在促进骨折愈合和恢复骨关节解剖和功能方面发挥着重要作用。目前，钛（Titanium，Ti）因其良好的生物相容性被广泛应用于骨科临床植入物。然而，钛的应力屏蔽效应尚未得到解决。应力屏蔽是指当植入物明显比宿主骨硬时，宿主骨承受的载荷比植入物小。长期缺乏负荷刺激会导致骨密度和骨吸收降低[2]，从而导致植入物松动甚至失效[3]。纯钛的弹性模量为110 GPa，远高于人类皮质骨的弹性模量15 GPa，这导致了应力屏蔽的产生[4]。因此，开发新型骨科植入材料具有重要的临床和科学意义。
1.1.1 PEEK的优点与不足
聚醚醚酮（Polyetheretherketone，PEEK）是一种高强度半结晶非金属聚合物。因其具有优异的机械强度和良好的生物相容性而被逐渐应用于骨科植入物领域[5,6]。PEEK不仅具有射线透射性，还具有与人体皮质骨相似的弹性模量（3-4 Gpa），这可以有效的消除应力屏蔽现象，并防止植入物因骨吸收而发生脱落[7]。这些优秀的特性使其具有成为钛替代品的潜力。目前，由PEEK制成的椎间融合器、关节置换装置、骨折固定器等骨科植入物已逐渐应用于临床[8,9]。尽管PEEK有如此多的优异性能，但欠佳的抗菌性能限制了它的临床应用。研究表明，在相同条件下，PEEK表面的生物膜形成率明显高于Ti，其对生物膜的亲和力是Ti的1-6.7倍[10]。这意味着一旦血液或组织中的游离细菌在PEEK表面定植，生物膜就会迅速形成导致植入物相关感染，最终导致植入物失败[11]。此外，生物膜很难被免疫系统清除，全身应用抗生素治疗效果也不令人满意[12]。手术移除植入物可能会使患者致残，并造成巨大的痛苦和经济负担。因此，为了扩大PEEK的临床应用范围，有必要提高其抗菌性能，以减少发生PEEK基植入物相关感染的概率。
1.2研究现状
抗菌肽（Antimicrobial Peptide,AMPs）是具有抗菌活性的小分子多肽，带有正电荷和两亲性结构[85,86]。它们是大多数生物体针对病原体的天然免疫防御机制的重要组成部分，具有优良的广谱抗菌性和低生物毒性。AMPs可以通过非特异性的静电相互作用与带负电荷的细菌细胞膜结合，通过破坏细胞膜导致细胞死亡。这样的抗菌剂机制使得细菌不容易产生耐药。此外，AMPs对细菌细胞膜具有高度选择性毒性，而不容易对哺乳动物的细胞造成损伤[87-89]。最近，有许多研究证实了抗菌肽可以提高生物材料的抗菌活性[86,90-95]。
目前，抗菌肽MBD-14和KR12已经成功应用于PEEK的表面抗菌改性。Yuan等人[32]将抗菌肽MBD-14冷冻干燥后固定在磺化PEEK上,体外抗菌实验表明，含高浓度MBD-14（10μg/mL）的样品对S.aureus和P.aeruginosa的抗菌率约为100%，在大鼠股骨感染模型中，将含有高浓度MBD-14（10μg/mL）的植入物在羊血琼脂平板上滚动，然后进行培养，未观察到S.aureus和P.aeruginosa菌落。Meng等人[33]用将抗菌肽KR12固定在PEEK上,体外抗菌实验表明，与对照组相比，改性后样品表面的S.aureus减少约50%。体内抗菌实验结果显示，将修饰后的样品植入大鼠股骨骨髓炎模型2周后，负载抗菌肽KR12的样品表面MSSA菌落数低于对照组。
HHC36（KRWWKWRR）是一种通过人工神经网络预测和设计出的一种含有9个氨基酸的高效抗菌肽，这种抗菌肽对包括MRSA在内的多种多重耐药“超级细菌”具有很高的抗菌活性，并且表现出比传统抗生素（妥布霉素、环丙沙星、亚胺培南、头孢他啶）以及临床候选抗菌肽（如MX226和hLF1-11）更好的抗菌性能[96,97]。近年来，有一些报告表明部分生物材料的抗菌活性在整合了HHC36后得到了改善[98-103]。
第2章材料与方法
2.1实验设备与材料
2.1.1主要试剂和材料
2.2实验方法
2.2.1样品准备
将圆盘形的Ti和PEEK（10mm×1mm）用不同等级的碳化硅砂纸(800#、1200#、2000#、5000#)抛光，并依次在丙酮、乙醇和超纯水中超声清洗并烘干。将PEEK圆盘放入盛有98%浓硫酸的锥形瓶并磁力搅拌5分钟，随后放入去离子水中终止反应。然后在120℃进行水热处理4 小时以去除表面残留的硫酸，将经过磺化和水热处理过的PEEK命名为SPEEK。随后，将50μL浓度为1.5mg/mL的HHC36乙醇溶液滴加至SPEEK表面，然后轻轻风干直至完全干燥，该加载过程重复20次。HHC36加载完成后，用磷酸盐缓冲溶液轻轻冲洗样品三次，以去除表面松散粘附的肽。将加载HHC36的SPEEK被命名为HSPEEK。然后使用相同的加载程序，将HHC36加载到未经处理的PEEK表面上。加载HHC36的PEEK被命名为HPEEK。
2.2.2样品表征
使用FESEM和EDS获得Ti、PEEK、SPEEK和HSPEEK的FESEM图像和EDS光谱。利用接触角测量仪评估样品的表面亲水性或疏水性。将超纯水（5μL）滴在样品表面，使用数码相机拍摄照片并记录接触角。
2.2.3体外释放研究
将HSPEEK浸入10mL PH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中。在37℃恒定振荡（30rpm/min）下孵育不同时间（4、12、24、48、72、120和168小时）。每个时间点收集0.3mL溶液，随后补充新的PBS溶液，以保持溶液总体积恒定。收集工作结束后，用BCA磷酸盐试剂盒检测上清液中的HHC36含量。
第3章实验结果........................22
3.1样品表征..............................22
3.1.1材料表面形态....................................22
3.1.2材料表面化学成分.............................22
第4章讨论..............................32
第5章结论...................................34
第4章讨论
在本次工作中，我们利用简单的磺化技术和溶剂蒸发法将HHC36添加到SPEEK表面。磺化工艺是一种简单可控的改性技术，可以在聚合物表面形成3D网络状结构，并使其作为载药平台来发挥成骨、抗炎、抗菌等功能[104-110]。已经有许多研究人员在PEEK表面进行磺化，并利用其多孔结构负载抗菌剂，赋予PEEK抗菌性能[27,30,32,111]。除了多孔结构，静电亲和力也为HHC36在SPEEK表面的负载做出了贡献。抗菌肽HHC36是一种带有5个正电荷的多肽，等电点为12.31。Kazemzadeh-Narbat等人[112]发现HHC36可以被加载至具有多孔结构的磷酸钙（CaP）涂层上，HHC36的带正电的残基和带负电荷的磷酸基团之间存在静电亲和力，这在一定程度上赋予了CaP涂层的的缓释HHC36的能力。Ouyang等人[83]测量了经磺化和水热反应处理后PEEK表面的Zeta电位，发现其表面带负电荷。我们推测HHC36中带正电的残基与SPEEK表面带负电的磺酸基团之间也存在类似的静电亲和力。这有助于解释为什么HHC36在经过初期爆发释放后仍然能平缓释放至10天。基于HSPEEK的独特的释放特性，HHC36可以在手术早期被快速释放以控制初期感染，然后缓慢释放以防止潜在感染。
植入物相关感染被认为是导致植入失败的重要因素。在骨科手术过程中，植入物容易受到周围环境中的细菌的污染。游离的细菌会粘附在植入物表面并迅速演化成生物膜。一旦在植入物表面的生物膜成熟，人体免疫系统和外部抗生素将很难清除它们，这将导致植入物失败[113-115]。因此通过杀死游离细菌来抑制生物膜的形成是一种有效预防细菌感染的措施。在本次工作中，体外抗菌试验表明，HSPEEK可以杀死S.aureus和E.coli的细菌悬浮液中超过99%的细菌。这与HSPEEK组周围的细菌悬浮液的澄清和OD600nm值是一致的。游离细菌的死亡可以归因于HHC36对细菌膜破坏的作用。扫描电镜结果显示，HHC36可以有效破坏S.aureus和E.coli的完整性，这可能会使细菌内容物外流而死亡。Chen等人[116]使用聚集诱导发射探针实时监测HHC36与细菌结合的过程，观察到了HHC36在细菌膜上的聚集和对膜结构的破坏，以及随后的细菌内部核酸或蛋白质流出。有学者同样发现HHC36具有破坏细菌细胞膜完整性的能力[117]。
第5章结论
我们通过简单的磺化技术和溶剂蒸发法将抗菌肽HHC36成功固定在SPEEK的3D多孔结构中，体外抗菌结果显示HSPEEK对S.aureus和E.coli均表现出优秀的抗菌活性，可以杀死游离细菌并抑制细菌生物膜形成。体外细胞学实验结果表明HSPEEK具有良好的细胞相容性。此外，HSPEEK在大鼠皮下感染模型中也具有优秀的抗感染能力，不仅可以减少材料表面的细菌存活率，还可以降低由细菌带来的炎症反应。本研究为提高PEEK的抗菌性能提供了新的策略，在开发PEEK基骨科植入物方面具有广阔的应用前景。
参考文献（略）