本文是一篇医学论文，本研究对所制备的PTP支架进行了相关生物学评价，结果显示PT支架及PTP支架均具有良好的生物相容性，BMSCs在两种支架表面伸展良好，并伸出伪足，细胞活死实验也未显示出有毒性的证据，可用于后续实验。
第1章 绪论
1.1 生物3D打印技术
骨骼是一种动态的、受神经支配和血管化的组织，具有在受伤后再生的内在能力，然而严重的骨缺损将导致骨折无法自愈，这些因素包括骨肿瘤切除、感染、严重创伤甚至发育畸形等[1]，因此通常需要使用手术方法来恢复骨缺损。在所有临床可用的移植物中，自体移植物仍然被认为是骨替代的金标准[2]，因其需要开辟第二术区、供区发病率高和手术时间延长等缺点而限制了其临床应用[3]。同种异体移植物或异种移植物存在免疫反应并发症、疾病传播风险和缺乏成骨特性等问题，存在导致骨吸收、骨不连和失败的风险[4]。
传统支架制作方法包括静电纺丝、冷冻干燥、气体发泡、颗粒或孔隙浸出等，这些制作方法只能控制支架的整体特性，而不能精确控制内部结构和拓扑结构[5]。3D打印，又称增材制造，是基于分层制造的原理，材料逐层重叠，该技术可用于根据计算机辅助设计（CAD）模型或计算机控制下的计算机断层扫描 （CT），通过使用实体建模精确累积材料，快速制造具有任何复杂形状的组件[6]。生物3D打印可以使用细胞、蛋白质和生物材料构建三维（3D）结构，有望成为骨组织工程（Bone tissue engineering，BTE）领域的强大工具 [7]。3D 打印的主要方法包括熔融沉积制造（FDM）、立体光刻（SLA）、选择性激光烧结 (SLS)、喷墨打印、喷墨生物打印、挤压生物打印和激光辅助生物打印[8]。在骨缺损的治疗中，三维多孔支架在骨科领域备受关注。在外观和微观结构方面，通过 3D 打印技术创建的复杂骨骼支架与人体骨骼相似。在此基础上，结合细胞和生长因子等活性物质，更有利于骨组织重建，对骨缺损的个体化治疗具有重要意义[9]。
1.2 人参皂苷的分类
中草药产品因其多种活性成分和有益效果而被广泛应用于医药、食品生产和其他领域，除了众所周知的多酚和黄酮类化合物外，皂苷也是草药中非常重要的活性物质。
人参的大部分药理和生物活性作用是由各种人参皂苷产生的[28]，从人参中提取的稀有人参皂苷具有重要的生物活性，包括免疫调节[29]、抗氧化[30]、抗炎[31, 32]、抗糖尿病[33]和抗肿瘤作用[34]。人参中的生物活性化合物约有三十种三萜苷，称为人参皂苷。迄今为止，已鉴定出 100 多种人参皂苷化合物[35]。从化学角度来看，根据它们的糖苷配基部分的不同可将这些糖苷分为 20（S）-原人参二醇（PPD）型和20（S）-原人参三醇（PPT）型，前者包括人参皂苷 Rb1、Rb2、Rg3、Rc 和 Rd等，后者包括人参皂苷 Re 、Rg1、Rg2 和 Rh1等[36]。口服的原人参二醇型人参皂苷最终被肠道菌群代谢为20（S）-原人参二醇 （PPD）。人参皂苷如Rb1、Rg1、Re、Rb2和Rh1等，对骨再生具有积极作用，促进成骨细胞增殖和成骨，并能抑制破骨细胞的活性[37-39]。
第2章 20（S）-原人参二醇成骨作用研究
2.1 实验材料、试剂和仪器
2.1.1 实验材料与试剂
表2.1为本实验用到的主要实验材料与试剂。
2.2 实验方法
2.2.1 骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离和培养
将7天左右的雄性 SD 大鼠深度麻醉处死后，使用无菌器械分离大鼠双侧股骨与胫骨。用无菌注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基对股骨及胫骨的骨髓腔反复冲洗，得到单细胞悬液，收集至离心管中并以1000rpm离心5min，弃上清后重悬，转移至培养皿中，置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。培养3d后更换新鲜α-MEM 培养基，去除未贴壁细胞，待细胞长满80%～90%首次传代，培养至第 3 代用于后续实验。
2.2.2 CCK-8法检测药物毒性
将5mg PPD（分子式为C30H52O3,分子量为460.4）粉末溶解于5μl DMSO中，并用α-MEM培养基稀释成1mg/ml。设计细胞实验分组，实验组BMSCs分别加入浓度为2.5、5、10、20、40μg/ml PPD进行处理；对照组细胞不加PPD。取第3代BMSCs，计数后以5×103个/孔的密度接种于96孔板，按照上述分组处理1天、3天和7天。培养到达规定时间后每孔加入110μl预先配置好的CCK-8液（CCK-8：基础培养基=1:10），放入细胞培养箱内继续培养1h。使用酶标仪在450nm处测量吸光度（OD）值，汇总结果并进行统计分析。根据药物毒性筛选出一个实验组的浓度进行后续实验。
第3章 3D打印PLGA/β -TCP/PPD复合支架的制备和表征 ............. 16
3.1 实验材料、试剂和仪器 ............................. 16
3.1.1 实验材料与试剂................................ 16
3.1.2 实验仪器 .................................... 16
第4章 3D打印PLGA/β-TCP/PPD复合支架的生物相容性研究 ...... 24
4.1 实验试剂和仪器 ................................... 24
4.1.1 实验试剂 .................................... 24
4.1.2 实验仪器 ................................ 24
第5章 3D打印PLGA/β-TCP/PPD复合支架的体内外成骨性能研究 .................................... 29
5.1 实验试剂和仪器 ................................... 29
5.1.1 实验试剂 .......................................... 29
5.1.2 实验仪器 ................................... 29
第5章 3D打印PLGA/β-TCP/PPD复合支架的体内外成骨性能研究
5.1 实验试剂和仪器
5.1.1 实验试剂
第6章 总结与研究展望
6.1 总结
本文针对临床中常见的骨缺损问题，利用生物3D打印技术设计和制备了具有生物活性的骨支架材料。我们首先证明了20（S）-原人参二醇（PPD）的成骨生物活性，然后以可生物降解的PLGA/β-TCP为基本材料，将PPD原位负载到3D打印PLGA/β-TCP支架（PTP）中，并对PTP支架进行一系列表征、细胞相容性及体内外成骨性能进行检测。具体工作及结论如下：
（1）本研究证明PPD能够通过提高成骨相关因子的表达进而促进BMSCs的成骨分化能力，为骨组织工程中临界骨缺损的修复提供了理论依据。
（2）本研究通过3D打印技术成功制备出粗糙多孔的复合支架，粗糙表面将有利于细胞的粘附；本研究所制备的支架孔隙率在67%以上，压缩强度及杨氏模量均在5Mpa及10Mpa以上，有利于承重部位的应用；通过3D打印技术原位负载促成骨药物，可缓慢持续释放药物促进骨缺损的修复。
（3）本研究对所制备的PTP支架进行了相关生物学评价，结果显示PT支架及PTP支架均具有良好的生物相容性，BMSCs在两种支架表面伸展良好，并伸出伪足，细胞活死实验也未显示出有毒性的证据，可用于后续实验。
（4）本研究制备的PTP复合支架在降解过程中没有产生有毒物质的迹象，不仅可以保持药物活性，而且可以缓慢持续释放PPD，在体外能促进BMSCs的成骨分化，在体内能促进大鼠颅骨缺损的修复，增加新骨形成量并促进骨缺损的愈合。
参考文献（略）