生理学和治疗学中的硝酸根-亚硝酸根-一氧化氮通路
摘要:以前认为无机的硝酸根和亚硝酸根阴离子是内源一氧化氮代谢的无活性最终产物。然而,近年研究显示这些所谓的无活性阴离子在体内通过再循环生成一氧化氮,区别于经典的L-精氨酸-一氧化氮合酶通路,是医学论文发表另一条重要的替代的一氧化氮源,特别在缺氧状态时。本文讨论了硝酸根-亚硝酸根-一氧化氮通路非常重要的生物功能,强调了那些提示硝酸盐和亚硝酸盐在一些病理条件下具潜在治疗作用的研究,例如在心肌梗死、卒中、全身和肺动脉高压症及胃溃疡等。
关键词:硝酸根;亚硝酸根;一氧化氮
一般认为硝酸盐和亚硝酸盐是食物中不受欢迎的可能有致癌作用的物质,或者认为是内源一氧化氮(NO)代谢生成的无活性最终氧化产物。然而,过去10年进行的研究充分显示,硝酸根和亚硝酸根在血液和组织中通过生理再循环形成NO和其他有生物活性的氮氧化物。因此,这些阴离子应看作是NO样生物活性物的贮池,是对一氧化氮合酶(NOS)依赖通路的补充。对这种哺乳动物中氮原子循环的认识,促使研究者探讨硝酸根和亚硝酸根在生理过程中的作用,也就是NO的调节作用。食物或内源硝酸根的生物激活需要先降解为亚硝酸根,而哺乳动物体内缺少特异的有效硝酸根还原酶,转换主要靠共生在胃肠道和身体表面的细菌来完成。氮氧化物的氧化还原过程中亚硝酸根处于氧化和还原信号之间,且在血液和组织中相对稳定。一旦生成亚硝酸根,体内许多通路可使其还原成NO,包括血红蛋白、肌红蛋白、黄嘌呤氧化还原酶、维生素C(抗坏血酸)、多酚和质子。缺氧酸中毒状况可极大增强此通路中NO的生成能力,因而保证了生成足够的NO。在生理和病理性缺氧时亚硝酸根还原成NO和NO修饰蛋白,似乎参与了生理缺氧信号的传递、血管扩张、调节细胞呼吸和对缺血应激的细胞反应。本文综述了体内NO代谢及其生物作用,讨论了硝酸盐和亚硝酸盐对多种疾病潜在的治疗效应,如缺血再灌注损伤及胃溃疡等。
1 硝酸根和亚硝酸根的来源体内硝酸根和亚硝酸根有2个来源:即内源L-精氨酸-NOS通路和食物。NO在血液和组织中氧化成硝酸根和亚硝酸根。NO和氧化血红蛋白反应产生硝酸根和高铁血红蛋白,由胞浆中NO氧化酶铜蓝蛋白催化生成亚硝酸根。在敲除NOS小鼠中,血循环中亚硝酸根水平降低70%,而缺乏铜蓝蛋白的小鼠或人,亚硝酸根水平也较低,正常血浆中硝酸根水平在20~40μmol•L-1范围,而亚硝酸根水平很低(50~300 nmol•L-1)。一般体育运动增加内皮中NOS的表达和活性,血循环中产生较高水平的硝酸根。有全身炎症疾患时,例如败血症和严重胃肠炎,由于大量可诱导的NOS的产生,硝酸根和亚硝酸根水平增高极大。相反,在内皮功能异常疾病中,NOS活性降低,血浆中硝酸根和亚硝酸根水平通常很低。相当数量的硝酸根是从食物中摄入,许多蔬菜富含这种阴离子,如莴苣和菠菜。饮用水中也含有硝酸盐,虽然许多国家严格限制它的含量。一些防腐食物中可找到亚硝酸盐,最多的要数腌肉和火腿。
2 硝酸根的肠-唾液循环口腔中共生兼性厌氧菌利用硝酸根作为氧原子的替代电子接受体,由硝酸还原酶作用还原唾液中的硝酸根为亚硝酸根。食入含硝酸盐的食物后唾液中硝酸根水平达到10 mmol•L-1,亚硝酸根达到1~2 mmol•L-1。当唾液进入酸性胃中,许多亚硝酸根迅速质子化形成硝酸,进一步降解后形成NO和其他氮氧化物。食物中富含的维生素C和多酚能极大增强亚硝酸根还原为NO的能力。灭菌后无菌大鼠在食入硝酸盐食物后,胃中形成的NO几乎可忽略不计,说明口腔中细菌对胃中NO产生的重要性。
3 亚硝酸根的扩血管作用虽然半世纪前已知道外源亚硝酸根药理剂量有扩血管作用,而这种阴离子扩血管的生理作用却被忽视,甚至近代的研究中都如此。然而,亚硝酸根通过人前臂的动静脉梯度在运动应激时消耗增加,提示亚硝酸根是通过外周循环代谢。此外,当血浆中亚硝酸根增加时前臂外周血液中NO也增高,提示亚硝酸根可能是血循环中NO样生物活性的稳定自分泌载体和传感器。最近的对正常志愿者进行的剂量-反应试验发现,食入浓度低于300 mmol•L-1亚硝酸盐,前臂中已呈现明显扩血管作用,血压也明显降低,此时血浆中亚硝酸根水平增加140 ~200mmol•L-1。
4 体内亚硝酸根还原通路
4•1 血红蛋白的异构化亚硝酸根还原酶活性在亚硝酸滴注入人前臂血循环时,扩血管作用与血中NO形成相关,正如测定铁-亚硝基血红蛋白生成速率所示。血红蛋白氧饱和度的降低伴随NO生成速率的增加,提示缺氧是调节亚硝酸根生物激活的机制。这些生理学发现与1947年Brooks和1981年Doyle等描述的亚铁血红蛋白的亚硝酸根还原酶活性一致。据此,亚硝酸根与亚铁血红蛋白及1个质子反应,生成NO和高铁血红蛋白。/然后NO和另一个亚铁血红蛋白结合生成硝化血红蛋白。此单一反应提示自然产生的亚硝酸根是其底物,需要血红蛋白去氧化,故具缺氧敏感性质,需要1个质子,故也具pH敏感性质,最后产生最强扩血管剂NO。这些化学性质及生理学研究提示,血红蛋白可能有异构亚硝酸根还原酶的功能,参与缺氧信号传递和缺氧扩血管过程。
4•2 肌红蛋白、黄嘌呤氧化还原酶和其他通路对敲除肌红蛋白小鼠的研究提示,亚硝酸根和肌红蛋白在调节心肌能量和生理缺氧条件下氧利用中起重要作用。与上述结果一致,Larzn等对年轻健康志愿者的研究发现,在补充亚硝酸盐饮食后进行低限量运动,全身氧耗较对照组明显降低。此种作用与血浆中亚硝酸根代谢有关。数种酶,包括黄嘌呤氧化还原酶,细胞色素P450和NOS,均显示利用亚硝酸根作用分子氧的替代电子接受体生成NO。例如,黄嘌呤氧化还原酶还原分子氧为超氧化物,但在低氧和低pH时,此酶也能还原亚硝酸根为NO。降低超氧化物将有效地增加血管中NO的生物利用度。亚硝酸根除增加NO产生外,另一个作用是作为内在信号传递分子,可能直接修饰血红蛋白或蛋白上的靶硫醇基。
5 用于治疗的可能性
5•1 扩张血管已有许多研究证实低剂量亚硝酸盐对小鼠、大鼠、绵羊、犬、猴和人都有扩血管作用。递送治疗性亚硝酸根以扩张缺血的血管,在临床前研究中显示大有希望。蛛网膜动脉瘤自发出血病人有发生延迟性脑动脉痉挛的危险,猴模型上显示这种痉挛和脑脊液中急性亚硝酸根耗竭有关,故滴注亚硝酸盐2周可预防此并发症。大多数新生儿肺动脉高压与肺血管高阻力及全身极低氧状态有关,绵羊模型上吸入亚硝酸盐,在肺中转换为NO能选择性扩张肺血管。对此种以局部缺血,血管收缩为特征的疾病,亚硝酸盐可作为一个理想、稳定、产生治疗作用NO的供者。无机硝酸盐、亚硝酸盐阴离子扩血管生物活性与有机硝酸酯(硝酸甘油)、亚硝酸酯(亚硝酸异戊酯)明显不同,有机硝酸酯和亚硝酸酯扩血管作用较亚硝酸盐更强。虽然在体内有机硝酸酯和亚硝酸酯代谢为扩血管的NO和亚硝酸盐,此种生物激活需要由线粒体乙醛脱氢酶和其他酶代谢,但都会引起耐药,即慢性给药后硝酸甘油生物活性降低。1930年的研究表明,无机亚硝酸盐不引起耐药,提示作为硝酸甘油活性代谢物的重硝酸盐可以绕过硝酸甘油酶性代谢和耐药。
5•2 缺血再灌注组织损伤的保护亚硝酸根不依赖NOS生成NO,首次在缺血心脏实验中证实,在长时间缺血和血液再灌注的肝、心、脑和肾中,生理和治疗水平亚硝酸盐呈现强细胞保护作用。这些发现提示亚硝酸盐对人类缺血再灌注损伤相关疾病可能有治疗作用,如心肌梗死、卒中、实质器官移植、心脏骤停和镰刀细胞病等。小鼠剂量-反应研究提示亚硝酸盐治疗剂量的安全范围达3个数量级, 0•1~100μmol•L-1均有显著保护作用。亚硝酸盐保护作用在非常低血浆浓度时更明显(小于200 nmol•L-1),而在浓度超过•228•Journal ofInternationalPharmaceuticalResearch 2008 Jun; 35(3)100~1 000μmol•L-1时丧失,这些研究中最低剂量亚硝酸盐仅使血浆亚硝酸根升高20%。动物实验资料证实,当动物使用NO消除剂羧基PTIO时细胞保护作用丧失,提示NO在细胞保护机制中的重要性。预先使用NOS抑制剂或敲除小鼠NOS细胞保护不被抑制,证明亚硝酸根的作用独立于NOS之外。缺氧组织中亚硝酸根形成NO的通路尚待确定。兰根道尔夫离体心脏实验提示血红蛋白通路对此功能不是必需的。有趣的是,亚硝酸根对线粒体和组织细胞保护的效应发生在急性(再灌注前立即给予)和预给(再灌注前24 h时给予)方式下,提示亚硝酸根可能是缺血先决条件的效应器。此外,吸入NO可减少小鼠、猪心肌梗死的体积,减轻人原位移植肝损伤的程度。这些效应与血循环中亚硝酸根明显增高有关,而血中S-亚硝基硫醇水平无明显变化。NO治疗可明显降低呼吸衰竭新生猴脑损伤的发生率,是血中NO介导的自分泌转运至中枢神经系统的效应。基于心肌梗死辅助治疗的考虑,美国国立心、肺和血液研究所与欧洲研究中心合作,计划进行人静脉滴注亚硝酸盐治疗心肌梗死后ST为升高的Ⅱ期临床试验。
5•3 胃溃疡非甾体消炎药最常见和严重的不良反应是继发于抑制前列腺素合成发生的胃溃疡。同样,在动物模型上发现,抑制NOS导致动物对致溃疡药物的敏感性增加。最近的研究中,给予大鼠硝酸钠饮水1周,然后用胃管给予双氯芬酸,此饮水中硝酸盐增加胃中NO水平,有效减少了非甾体消炎药引起的肉眼可见的溃疡。此外,预先给予硝酸盐可降低黏膜中髓过氧化物酶活性和iNOS的表达,说明组织炎症得到减轻。由硝酸盐提供的保护可能与胃黏膜血流增加,黏膜再生和内皮通透性减弱有关。大鼠硝酸盐的胃保护效应,如果局部先用抗生素就不起作用,说明口腔菌群对硝酸盐生物激活的重要性。
5•4 抗微生物作用亚硝酸盐用作肉类防腐剂,抑制病原体生长,其中最著名的是肉毒杆菌,这些抗菌作用得益于生成的NO。在酸性胃液中发现内源性亚硝酸根还原为NO,促使研究者探讨使用酸化亚硝酸盐作为抗菌剂。的确,酸化亚硝酸盐产生NO和其他氮氧化物,对许多病原体有强抗生活性,包括沙门菌属、鼠疫杆菌和志贺菌属、幽门螺杆菌和铜绿假单胞菌。近来对亚硝酸盐在气道上的抗菌效应进行了研究,在动物囊性纤维化气道模型上,酸化亚硝酸盐成功清除了气道中的黏液状铜绿假单胞菌,此菌是气道囊性纤维化患者中常见的病原体。由于细菌还原尿中硝酸根,故感染的尿液中通常含有相当数量的亚硝酸根。虽然在中性或碱性条件下亚硝酸根是稳定的,但如果尿道轻度酸化(pH 5~6),亚硝酸根就还原成NO,有强抑菌效应,此效应在还原剂维生素C存在时得到加强。事实上,体外亚硝酸盐和抗坏血酸的抗菌强度与传统抗菌药完全相当,如硝基呋喃和甲氧苄啶。食入维生素C酸化尿液已常规用于预防和治疗尿路感染。
6 开发为药物的可能性
6•1 局部给予酸化无机亚硝酸盐无机亚硝酸盐,如亚硝酸钠伍用酸化剂如维生素C,可迅速释放NO和其他氮氧化物,已进行抗菌活性评价。已证明局部用于各种皮肤感染有效,并在气道囊性纤维化动物模型上显示可杀死黏液状假单胞菌。Carlsson等用此充气囊的导尿管递送亚硝酸盐和维生素C至膀胱中用于抗菌,体外实验发现,产生的NO扩散到尿液中可杀死尿液中的大肠埃希菌,建议使用这种方法预防导管引起的医院获得性尿路感染。
6•2 肠内给予无机亚硝酸盐和硝酸盐健康志愿者食物中短期补充硝酸盐显示血压降低。口服硝酸盐和亚硝酸盐在理论上很有吸引力,因为亚硝酸盐可保证吸收后迅速起效,而硝酸盐在较长时间内继续提供缓慢释放的亚硝酸盐,如上文中肠-唾液再循环中所述。新近开发的NO-非甾体消炎药,活性药物和有机硝酸酯结合,另一是无机硝酸盐和致溃疡药如阿司匹林或其他非甾体解热镇痛药组成复方。
6•3 有机硝基化合物作为亚硝酸根供体在肠内给予无机硝酸盐或亚硝酸盐生物利用度很难控制,因为这些阴离子在胃肠道中的代谢各异。然而,使用有机烯丙基硝基化合物作为亚硝酸根供体可能克服这种困难,体外实验显示这些化合物在硫醇(L-半胱氨酸)和抗坏血酸存在时释放亚硝酸根和NO。但这些有机烯丙基硝基化合物在体内能否成为亚硝酸根供者尚待研究。
6•4 毒性无机亚硝酸盐和硝酸盐影响健康的两大问题是、数学和理论模型,以及预测工具。由于对人免疫系统和病原体遗传的进一步了解,以及测试设备和生物信息学的进步,为人类群体疫苗免疫反应的可变异性提供了新的认知,免疫组学成为现代疫苗学的中心。
4 基于基因组学和蛋白质组学的疟疾疫苗
4•1 疟疾基因组序列分析疟疾基因组序列的分析为药物和疫苗的开发提供了有希望的新型先导药物。保护T细胞或抗体反应的靶标鉴定是基因组序列分析的核心。然而,由于疟疾基因组很大,识别能够针对靶标病原体刺激最有效免疫性的抗原仍然具有很多问题。
4•2 疟疾蛋白质组研究23-Mb恶性疟原虫基因组由5 300多个蛋白质编码,每个都是保护免疫反应的潜在靶标。然而,目前亚疫苗的生产仅仅基于一个或几个抗原,因而所能引起的反应太窄。蛋白质组学和对数据库的计算机分析正被用于建模和探讨多个关键疟原虫蛋白质的三维结构,这推进了疟疾疫苗的设计。细菌和酵母的重组蛋白质表达与环磷酸腺苷(cAMP)的纯化技术相结合已鉴定了数十种疟疾蛋白质抗原。Aguiar等考察了使用门控系统产生大量表达编码恶性疟原虫单个外显子基因克隆的高通量克隆方法的可行性。在这项工作中,把标准克隆及其开放读框(ORF)转染到多重表达载体,通过特定的标准,包括阶段表达和次级结构,选择出靶标基因并亚克隆到一个DNA疫苗载体中。在动物模型中,观察到了能产生针对寄生虫各阶段的抗体的基因功能表达。
4•3 医学论文发表疟疾疫苗计算机设计由于生物信息学和化学信息学的进步,计算机疫苗设计已成为可能。一些生物信息学和化学信息学工具可被应用于疟疾疫苗的开发。从整个疟原虫基因组序列开始,可预测作为疫苗候选物的蛋白质。潜在的疫苗候选物将通过蛋白质组学和计算机分析研究。〔编译自:W iwanitkitV. Vaccination formalaria based on genomics andproteomics[J].DrugsFut, 2007, 32(2): 171-177.〕(上接第229页)发生高铁血红蛋白血症及其潜在的致癌效应。动物研究中观察到亚硝酸盐静脉注射产生细胞保护和扩血管作用时,一般只检测到微量高铁血红蛋白,提示在有效剂量范围内高铁血红蛋白不是一个问题。事实上,半效量时,成人体内高铁血红蛋白约为1 g,而从动物实验资料推算,治疗心肌梗死70 kg成人用量只需40 mg亚硝酸盐。2001年,美国卫生教育福利部国家毒理研究中心公布了大鼠和小鼠亚硝酸钠广泛毒理学和致癌性研究资料。在饮水中供给亚硝酸钠14周,在为期2年的基因毒理学,伤寒沙门菌及大鼠和小鼠骨髓和外周血等研究中均未发现亚硝酸盐有明显致癌证据,尽管大鼠剂量已渐增到足以产生明显的高铁血红蛋白水平和体重降低。
7 结语硝酸根-亚硝酸根-NO通路可视为对经典的L-精氨酸-NOS通路的补充。这些通路,部分是平行起作用,但当缺氧和NOS活性降低时,亚硝酸根还原为NO的过程增强。因此,在病理条件下,当局部和全身缺血时,硝酸盐和亚硝酸盐作为药物使用或干预饮食可能有益。现在必须修正长期以来的观点,即硝酸盐和亚硝酸盐只是食物中的有害物质或内源NO的无活性代谢物。积累的证据提示,硝酸根-亚硝酸根-NO通路的确参与生理缺氧NO信号传递,也为开发新的基于NO作用的治疗药提供机会。