本文是一篇医学论文，本研究通过对去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物进行水解获得去甲乌药碱，探究两者之间定量离子峰面积转换关系，获得转换因子。通过转换因子进行对去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物的半定量分析。
第一部分去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物体外肝微粒体孵育以及转换因子实验
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂
去甲乌药碱标准品购自四川维克奇生物科技有限公司；内标-盐酸多巴酚丁胺购自美国Sigma公司；尿苷二磷酸葡糖醛酸（Uridine5′-diphosphoglucuronicacidtrisodiumsalt，UDPGA）购自美国Sigma-Aldich公司；葡糖二酸单内酯（D-Glucaricacid-1,4-lactonemonohydrate）购自美国Sigma-Aldich公司；MgCl2·6H2O和丙甲菌素购自北京百灵威科技有限公司；混合人肝微粒体（HLM）购自上海瑞德肝脏疾病研究有限公司；β-葡萄糖醛酸苷酶购自上海源叶生物科技有限公司；三水乙酸钠（CH3COONa·3H2O）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；乙腈和甲酸均为色谱级，购自美国Sigma公司，其余试剂均为分析纯。
1.1.2仪器
Agilent 1290 infinityⅡ超高液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent 6550四极杆-飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司）；LC-30A HPLC(岛津，日本)；QTRAP5600+（AB，美国）；A10 Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；ET3301全自动氮吹浓缩仪（上海欧陆科仪（远东）有限公司）；Vortex-Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；HX-10迷你恒温金属浴（上海沪析实业有限公司）。
2结果
2.1经HPLC-Q-TOF-MS进行去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物确定
经过Agilent MassHunter Qualitative Analysis Navigator B.08.00软件计算得到的理论去甲乌药碱[M+H]+形式的质荷比为272.1281，Glu-HG的[M+H]+形式的理论质荷比为448.1605；将对照组0 h与实验组0.5 h、1 h、2 h以及4 h的质谱结果进行对比，发现在对照组中检测到去甲乌药碱原体的质荷比272.1282，而未检测到Glu-HG的质荷比。在实验组2 h（经测定该时间组Glu-HG含量最高）中发现去甲乌药碱的质荷比和Glu-HG的质荷比，两者的质荷比与理论质荷比对比相差在20 ppm以内。将实验组中的Glu-HG质荷比进行Targeted MS/MS碎裂去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物分子离子得到碎片离子峰，结果发现Glu-HG碎片分子中出现HG原体分子的质荷比272.1282以及HG的一个碎片离子质荷比255.0999，符合葡萄糖醛酸结合物的质谱行为特征，从而确定Glu-HG的存在。结果如图1-1~1-4所示。
第二部分去甲乌药碱、去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物以及双酯型乌头生物碱的HPLC-MS/MS检测方法建立
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂
乌头碱、新乌头碱以及次乌头碱标准品均购自四川维克奇生物科技有限公司；Oasis HLB 1cc 30mg固相萃取柱购自waters公司；其余同第一部分1.1.1。
1.1.2仪器
同第一部分1.1.2。
1.1.3标准品储备液配制
乌头碱、新乌头碱以及次乌头碱标准品使用色谱级乙腈配制成1 mg/mL的储备液；去甲乌药碱标准品和内标多巴酚丁胺均使用色谱级甲醇：超纯水：甲酸（50：50：1）配制成1 mg/mL的储备液；所制备的储备液均避光保存于-20℃冰箱中。
2结果
2.1空白添加样品的检测
优化建立的样品前处理方法和仪器条件，对空白血浆和肝脏添加去甲乌药碱以及双酯型乌头生物碱进行检测，得到总离子流图（TIC）和MRM色谱图及质谱图，具体见图2-1~2-14。
第三部分 去甲乌药碱、去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物在染毒大鼠体内的毒物代谢动力学研究 ............. 29
1 材料与方法 .................... 29
1.1 仪器与试剂 .......................... 29
1.2 毒物代谢动力学实验 ............................. 29
第四部分 去甲乌药碱、去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物以及双酯型乌头生物碱在染毒大鼠体内的死后分布研究 .............. 34
1 材料与实验方法 ........................ 34
1.1 仪器与试剂 ...................................... 34
1.2 死后分布动物模型的建立 ............................... 34
3讨论
去甲乌药碱自身的毒性并不高，但在生草乌煎煮液中含有乌头碱，其毒性极高，为了模拟人在服用致死量的生草乌煎煮液的情况中去甲乌药碱的代谢情况，本实验采用的去甲乌药碱灌胃剂量参照生草乌煎煮液中乌头碱1/2LD50（LD50：0.85 mg/kg）对应剂量下的去甲乌药碱的含量，进行去甲乌药碱的计量换算灌胃。
本研究中血浆中均未检测到HG，而在空白添加中0.5ng/mL的添加均能检测到HG。因此本实验考虑可能有以下原因，去甲乌药碱在生草乌煎煮液中含量过低，经肠道吸收后集中分布在脏器，脏器对HG富集效果较好，蓄积在大鼠体内的脏器中，在后续的死后分布实验中也发现HG在血浆中无法检出，而在脏器中能够检测到HG，其中较高的脏器以肝脏和肾脏为主。目前仅见去甲乌药碱的药代动力学研究[49]，未见有关去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物的药代动力学研究。本实验考虑在后续的实验中加大去甲乌药碱的给药量进行对去甲乌药碱及其葡萄糖醛酸结合物的毒物代谢动力学研究。
HG在血液中代谢迅速，灌胃给药5 min后即可检出Glu-HG，考虑有肠道代谢的可能，因为肠道里也有一定含量的UGTs，即使肠道可能不是主要代谢HG的场所但是也可以作用于HG使其转化为Glu-HG，Glu-HG在不同大鼠血浆中的浓度1-3 h就达到峰值，在12 h时下降到较低水平，24 h以后检测不出。
综上所述，本研究获得了Glu-HG在大鼠体内的浓度-时间曲线和毒物代谢动力学参数，能较好地描述血浆中Glu-HG浓度随时间的变化规律，研究结果为后续推断乌头属中药中毒案件中毒时间推断提供毒物代谢动力学理论数据。
第四部分去甲乌药碱、去甲乌药碱葡萄糖醛酸结合物以及双酯型乌头生物碱在染毒大鼠体内的死后分布研究
4结论
对于怀疑是乌头属植物中毒或死亡相关的案件，选取检材依次推荐为：血液、肾脏、肝脏、肺脏和脾脏等血流量丰富的脏器，胃内有胃内容物的情况可以进行检材的提取以及相关的体外检材也可以进行提取送检。值得注意的是，送检的过程中，冰浴送检对检材的保护相对较好，并且需要我们相关工作人员及时送检以免相关检测成分分解导致检测结果假阴性。对于疑似乌头属中药中毒案件进行检测时，综合考察HG、Glu-HG以及DDAs的检测，对检测出Glu-HG成分同时检测出DDAs以及HG的案件，可以判断其为生前服毒。
参考文献（略）