本文是一篇医学论文，本研究首次阐明了MIF对人胚胎干细胞的具体作用及调控机制，对了解人胚胎干细胞的生理调控及其进一步的应用具有重要意义。
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1选用细胞株
本实验使用人胚胎干细胞H9购自上海中乔新舟生物科技有限公司（ZQ0692）。293T细胞购自中科院细胞库（SCSP-502）。
1.1.2实验材料
1.2实验方法
1.2.1解冻复苏人胚胎干细胞实验
（1）培养器皿的基质包被：准备干净无菌的细胞培养板（本实验使用六孔板），抽取1mL Matrigel工作液包被细胞培养板。轻轻晃动培养板，将Matrigel工作液均匀地覆盖到培养孔的表面，使用前至少在37℃条件下孵育1h。
（2）将水浴槽内加入适量净水，预设水浴槽温度为37℃。
（3）将冻存的细胞从液氮储罐取出，迅速对冻存管标记信息进行核对，（将冻存管盖子松一下以防炸裂）将冻存管在水浴槽中快速晃动，使细胞快速融化，冻存管表面用75%乙醇擦拭，放置于超净台之内。
（4）融化后的细胞加入DMEM/F12培养基1mL，盖紧盖子并放入离心机中。
（5）配平，设置离心机300×g离心5min。
（6）移去上清液，将细胞沉淀轻轻用含有ROCK抑制剂Y27632的mTeSR1培养基2mL进行吹悬2-3次。
（7）轻轻地将培养板往一侧倾斜，使多余的Matrigel包被液在一侧的边缘汇聚，移去多余的Matrigel包被液，将细胞悬液移入培养板中，注意加入动作要轻柔，贴边注入，晃动培养板使细胞均匀平铺于器皿底部。
（8）在培养板上做好标记，放置在37℃，5% CO2细胞培养箱内。24h后，换新鲜的不加ROCK抑制剂Y27632的mTeSR1培养基。
2. 结果
2.1人胚胎干细胞的生长培养与自分泌
为了解人胚胎干细胞(H9)的生长状况，用CCK-8实验检测人胚胎干细胞的生长曲线（图2.1A），可以看到正常生长的细胞为大小相对均一、胞质较为透明的形态，似铺路石样，细胞排列紧密，呈集落状生长。H9的对数生长期在3-6天，后续实验均用此期细胞进行（图2.1B）。在细胞正常的生长情况下，取培养液进行ELISA实验，实验结果表明生理情况下分泌MIF约为20ng/mL（表2.1）。
2.2 生理浓度的MIF促进人胚胎干细胞的增殖
为明确MIF对于人胚胎干细胞的作用，外源性添加了不同浓度的MIF(30、100、300ng/mL)到人胚胎干细胞的培养基中培养，在24h、48h、72h用CCK-8检测结果显示，不同浓度的MIF对人胚胎干细胞的生长活力并无影响（图2.2A）。外源性添加不同浓度的MIF的抑制剂ISO-1(2、7、21μM)到人胚胎干细胞的培养基中培养，在24h、48h、72h用CCK-8检测结果显示，ISO-1能够抑制人胚胎干细胞的生长，且呈现剂量依赖性的趋势（图2.2B）。为彻底了解MIF对人胚胎干细胞的作用，本研究用CRISPR/Cas9双载体慢病毒质粒系统对人胚胎干细胞进行MIF基因的敲除，通过向人胚胎干细胞内导入Cas9和sgRNA序列表达框，进而实现对MIF基因的敲除。从图中可以看出，慢病毒成功感染不同组的细胞（图2.3A）。用qPCR检测，1-sgRNA成功地对细胞进行效率约为50%的敲除（图2.3B）。敲除MIF基因之后的人胚胎干细胞生长活力显著降低，最后甚至难以继续生长（图2.4）。
3. 讨论 ............................... 39
4. 结论 .............................. 44
3.讨论
MIF的表达和分泌谱表明，MIF在几乎所有哺乳动物细胞中都有表达，对许多生理过程至关重要[10]。MIF主要通过其受体以自分泌和旁分泌的方式参与细胞的增殖、迁移、凋亡、分化等生物学功能。先前已经有过人胚胎干细胞自分泌MIF的相关研究，然而MIF对人胚胎干细胞的具体作用及其调控机制还尚未可知。因此，本研究首次阐明了MIF对人胚胎干细胞的具体作用及调控机制，对了解人胚胎干细胞的生理调控及其进一步的应用具有重要意义。
已有研究证明MIF能促进多种细胞的增殖存活。研究证明MIF通过AKT、ERK、AMPK、Wnt/β-catenin等多种通路促进神经干细胞的存活、增殖[18, 19]。MIF通过调节AKT-FOXO3a信号通路中的氧化应激，保护间充质干细胞免受缺氧/饥饿诱导的细胞凋亡[22]。鉴于MIF在细胞增殖和存活中的这些作用，研究还发现多种肿瘤高表达MIF，包括多形性胶质母细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、胰腺癌和肺癌[32-34]。越来越多的研究表明，血清中MIF的异常浓度反映了患者的病理状态。健康对照组的血清MIF浓度在0.2-8.3ng/mL之间[10]。而在不同的病理情况下，血清平均MIF浓度不同：登革热休克综合征(102ng/mL)、食管鳞状细胞癌(100ng/mL)、肺结核(19.84ng/mL)，多发性肌炎(50ng/mL)，白癜风(32.96ng/mL)，牙周炎(71.8ng/mL)和严重败血症(103.7ng/mL)[10]。研究结果显示，正常生长的人胚胎干细胞能够自分泌大约20ng/mL的MIF。为了探究人胚胎干细胞分泌如此高浓度的MIF的作用，本研究外源性添加不同浓度的MIF对人胚胎干细胞的增殖无影响，而通过添加MIF抑制剂ISO-1或者敲除细胞中的MIF，人胚胎干细胞的增殖和存活受到严重抑制，敲除MIF后的细胞甚至无法存活。MIF与其他因子的不同之处在于，MIF是半组成型表达，并且是预先从储存池中分泌到体内循环，以维持细胞的正常生理功能[35]。以上研究充分说明在正常的机体中能够恒定表达MIF，其生理浓度的MIF对于机体的正常生存必不可少
4.结论
1.人胚胎干细胞自分泌MIF，其自分泌的生理浓度约为20ng/mL，生理浓度的MIF促进人胚胎干细胞的增殖，并且对人胚胎干细胞的存活至关重要。
2.高于生理浓度的MIF通过降低KLF4的表达抑制人胚胎干细胞的自我更新，通过促进FOXA2的表达开启人胚胎干细胞分化的第一步。
3.MIF可能通过β-arrestin1介导的CXCR4内化来调控对人胚胎干细胞的信号传递。
参考文献（略）