本文是一篇医学论文，本研究借助代谢组学和微生物组学的多组学联合分析技术研究哪些代谢途径参与笑气诱导的毒性机制。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
Illumina NovaSeq 6000测序平台；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）；QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）；NEB Next®Ultra™DNA Library Prep Kit试剂盒；Agilent Bioanalyzer 2100；[email protected]荧光计（Thermo Scientific）；全身暴露静式毒理设备HOPE-MED 8050-3C（天津开发区合普工贸有限公司）；笑气（99.9%，河南源正特种气体有限公司）。
1.4高通量测序实验流程
1.4.1样本DNA提取
采用CTAB或SDS方法提取样本DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA的完整性，并用Quibt实时荧光定量DNA浓度。根据定量浓度，使用无菌水将DNA稀释至1ng/μL。
1.4.2 PCR扩增及纯化
基于Illumina测序平台构建小片段文库并进行双末端测序，选择使用带Barcode的特异引物和高保真DNA聚合酶对选定的V3-V4可变区（341F-806R）进行PCR扩增，反应体系和扩增条件如表2-1、2-2所示。
扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测目标片段400-450bp，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收目标片段，参照电泳初步定量结果，用Quanti Fluor™-ST蓝色荧光定量系统定量检测浓度，并按照上机要求等相应比例的混合样本。
2结果
2.1测序数据预处理及质控分析
下机的得到的数据以fastq格式保存，截去引物序列和Barcode序列后进行拼接，拼接得到的Tags序列为Raw Tags，然后再把低质量及短长度的序列进行过滤处理，得到高质量的Clean Tags，最后进行嵌合体序列的过滤、去除，得到最终能够用于后续分析的有效数据。各样本Q20均在98%以上，Q30均在95%以上，说明测该序结果可靠，该数据可以进行下游分析。
2.2物种组成分析
2.2.1 OTU聚类和物种注释
对所有样品的有效数据进行聚类，以序列间97%的一致性将序列聚类成为OTUs，然后使用Silva数据库对OTUs的代表序列进行物种注释，标注OTUs的分类等级及名称，研究物种组成多样性。根据OTUs聚类分析结果，绘制韦恩图，发现实验组和对照组有692个共有的OTUs（如图2-1所示）。
2.2.2群落结构分析
根据物种注释结果，比较各组物种的相对丰度，选择排名前10的绘制物种相对丰度柱形累加图，直观地展示各组群落结构及优势物种。如图2-2所示，在门水平上，实验组和对照组相对丰度排名前5的物种相同，包括拟杆菌门(Firmicutes)、厚壁菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）和脱铁杆菌门（Deferribacteres），以拟杆菌门和厚壁菌门占绝大多数。其中与对照组相比，实验组拟杆菌门和脱铁杆菌门物种相对丰度低，厚壁菌门、变形菌门和放线菌门相对丰度高，提示笑气滥用会明显降低拟杆菌门和脱铁杆菌门丰度，增加厚壁菌门、放线菌门和变形菌门丰度。如图2-3所示，在属水平上，实验组相对丰度排名前5的有：uncultured bacterium属、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、毛螺菌科-NK4A136菌属（Lachnospiraceae.NK4A136.group）、红蝽菌科属（Coriobacteriaceae.UCG.002）和粪杆菌属（Faecalibaculum），对照组相对丰度排名前5的有：乳酸杆菌属（Lactobacillus）、uncultured bacterium属、Dubosiella属、毛螺菌科-NK4A136菌属（Lachnospiraceae.NK4A136.group）和另枝菌属（Alistipes）。其中差异较为显著的是乳酸杆菌属、毛螺菌科-NK4A136菌属和另枝菌属，可以认为笑气滥用会明显降低肠道微生物乳酸杆菌属、另枝菌属的丰度，增加毛螺菌科-NK4A136菌属丰度。
2 结果 ........................... 33
2.1 测序数据预处理及质控分析 ............................... 33
2.2 物种组成分析 ............................. 33
2.3 物种多样性分析 ............................... 35
3 讨论 ............................................... 44
4 结论 ................................. 47
3讨论
本节主要是通过研究高通量测序分析细菌16S rDNA可变区，关注实验组与对照组粪便样品中细菌群落丰度及组成变化情况，探究微生物对笑气染毒小鼠代谢的影响，进而解释其作用机制。
通过稀疏曲线分析物种累积曲线分析，说明测序数据足够，测序的覆盖率较好，能够反映样本中绝大多数微生物群落的信息。α多样性指数分析结果显示与对照组相比，实验组菌群的物种丰富度显著升高，而菌群多样性无明显差异，说明笑气滥用干扰小鼠肠道菌群的稳态，一些优势细菌生长繁殖影响小鼠代谢途径变化。通过β多样性分析和组间群落结构差异显著性检验，我们进一步发现实验组与对照组间微生物菌群存在显著差异，且组间差异大于组内差异。
从群落结构分布角度来看，实验组和对照组在不同分类水平结构上的群落结构存在差异。在门水平上，以拟杆菌门和厚壁菌门占绝大多数，并且较对照组相比，实验组拟杆菌门和脱铁杆菌门物种相对丰度明显降低，厚壁菌门、变形菌门和放线菌门相对丰度明显升高。在属水平，较对照组相比，实验组乳酸杆菌属、另枝菌属的丰度明显降低，毛螺菌科-NK4A136菌属丰度明显升高。乳酸杆菌属（Lactobacillus）是一种对机体有益的菌群，在改善肠道微生态环境、增强肠道上皮细胞抵抗力以及为机体提供营养等方面发挥重要作用[61]；另枝菌属（Alistipes）是肠道的益生菌，不仅参与调控小鼠的能量代谢，而且增强小鼠的环境适应能力；毛螺菌科-NK4A136菌属参与与调控短链脂肪酸的代谢等，肠道微生物群不仅影响肠道活动，还在肠道代谢中发挥调节作用，说明肠道菌群丰度变化和代谢之间有密切联系。
全文小结
当前，我国吸食滥用“笑气”的危害已经开始显示出来，长期大量摄入N2O可引起维生素B12缺乏导致严重周围神经疾病，最常见感觉异常、步态不稳和肢体无力[77]；还会出现由于高同型半胱氨酸血症导致的肺动静脉栓塞、动脉血栓形成、精神疾病和缺血性卒中等临床症状。虽然已发现钴胺素在慢性N2O使用者神经损伤中有所下降，认为慢性N2O使用相关的神经损伤的核心是钴胺素代谢紊乱[52]，但仍没有确切地说法。因此，本研究借助代谢组学和微生物组学的多组学联合分析技术研究哪些代谢途径参与笑气诱导的毒性机制。
从血浆代谢组学来看，笑气滥用影响多条与氨基酸代谢相关的代谢通路，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、蛋白质消化与吸收、非洲锥虫病以及色氨酸代谢，破坏了肠道稳态导致肠道内免疫系统失衡出现恶心等胃肠道症状，也引起神经系统损害出现感觉异常、运动无力及短期记忆损伤、学习障碍等症状；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、嘧啶代谢和癌症中的胆碱代谢紊乱还引起机体DNA合成受限，胆碱蓄积甲基化中断，出现巨幼细胞贫血症相关。从粪便代谢组学来看，笑气滥用干扰了鞘脂代谢和cA MP信号通路2条代谢途径，不仅影响细胞生长、分化、增殖凋亡和代谢等重要细胞行为，产生神经毒性损害神经系统毒性，而且还引起肠道微生物紊乱，破坏了肠道菌群的稳态。
参考文献（略）