本文是一篇医学论文，本研究通过慢病毒表达载体构建USP1过表达及敲低的MDCK细胞系，发现USP1可以显著抑制MDCK细胞中流感病毒的增殖。
第一章 文献综述
1.1流感病毒与疫苗
1.1.1流感病毒概述
流感病毒属于正黏病毒科RNA病毒，分为甲型（Influenza A virus, IAV）、乙型（Influenza B virus, IBV）、丙型（Influenza C virus, ICV）及丁型（Influenza D virus, IDV），是常见的可引起呼吸道疾病的病毒[1, 2]。季节性流感病毒每年在全世界范围内可造成29万-65万人死亡和250万至500万重症病例，其中成年人年流感感染率为5-10%，儿童则为20-30%[3, 4]。除季节性流感流行外，流感病毒还不定期的引起大流行，1918年“西班牙流感病毒”（H1N1）[5]、1957年“亚洲流感”（H3N2）、1968年“香港流感”（H2N2）和2009年甲型H1N1流感[6, 7]。这四次流感大流行均是由甲型流感病毒引起的，每次的大流行都会严重威胁全球人类健康。
乙型流感病毒为单股负链RNA病毒, 病毒基因组均为8个大小不等的独立RNA节段,各节段分别编码10种不同的蛋白: 多聚酶（PA）、多聚酶PB1和PB2，负责通过唾液酸酸化细胞表面受体进行细胞附着和侵入及随后的膜融合的血凝素（HA），通过切割HA和唾液酸之间的键促进病毒在细胞中移动，加快新一代病毒子颗粒释放的神经氨酸酶 （NA），编码病毒基质蛋白（M1）和充当离子通道蛋白的病毒表面蛋白（M2）、参与免疫逃逸的非结构蛋白（NS1）及核基质蛋白（NP）[8, 9]。甲型流感病毒根据其表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同组合进一步分为不同亚型，这就使得每2-3年便出现新的甲型流感病毒抗原株[10]。
1.2 MDCK细胞基质流感疫苗
MDCK细胞系由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel 母曲架犬的肾脏组织分离培育建立，通常是以贴壁方式生长的上皮样细胞[31]。由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，同时可以广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如：呼肠孤病毒 (Reovius)、腺病毒 (Adenovirus)、犬细小病毒 (Canine parvo virus，CPV)、猫粒细胞缺乏症病毒 (Feline pan leukopenia virus，FPLV) 等[32, 33]。被公认为最适于甲、乙型流感病毒疫苗生产用的细胞系之一[34]，已被批准用于人用或兽用流感疫苗生产[35]。
随着基因编辑技术的发展，研究宿主细胞中与流感病毒相互作用的宿主蛋白，并通过基因工程手段改造细胞特性，是评价该宿主基因是否可以作为基因编辑高产疫苗细胞系构建靶标的重要理论依据。在MDCK细胞中，IRF7基因稳定敲除后，细胞内复制产生的流感病毒滴度增加了三至四倍[36]，STAT1基因敲除后，甲型流感病毒H1N1感染细胞后收获的流感病毒滴度比对照细胞提高三十多倍。因此从疫苗生产的角度出发，针对宿主抗病毒蛋白进行基因工程改造的高产流感疫苗细胞系的构建，是有效提高病毒在细胞内的复制水平，提高疫苗的生产效率重要手段。
第二章 流感病毒感染诱导USP1表达上调
2.1 材料
2.1.1 病毒和细胞
MDCK贴壁细胞(ATCC,#CCL-34)、A549细胞、HEK-293细胞由中国甘肃省动物细胞工程中心提供。Influenza A/Puerto Rico/8/34 (A/PR/8/34) H1N1 virus、A/Texas/50/2012(H3N2)NYMCX-223A、B/Colorado/06/2017- like virus B (Victoria lineage)、B/Phuket/3073/2013-like virus B (Yamagata/16/88 lineage) 由武汉生物制品研究所有限责任公司疫苗研究二室提供,保存于-80℃。将MDCK、HEK-293细胞维持在DMEM培养基中，补充10%NBS/FBS血清，A549细胞维持在1640培养基中，补充15%NBS血清，所有细胞均在37℃、5%CO2条件下进行培养。
2.1.2 主要试剂
RIPA裂解缓冲液(PC101)、PMSF(GRF101)购自上海雅酶生物医药科技有限公司； PBS缓冲液、DMEM、1640培养基购自Cellmax技术（北京）有限公司；新生牛血清/胎牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；抗 IBV NP及IAV NP兔源单克隆抗体（ab20711、ab128193）购自AbCam；抗USP1鼠多克隆抗体（Cat：SA00013-3）购自proteintech；抗β-actin 鼠源单克隆抗体（Cat：66009）购自CST。
2.2 实验方法
2.2.1流感病毒感染
将生长状态良好的野生型MDCK（CCL-34）细胞、HEK-293、A549 细胞分别以7×105/孔接种至6孔板中，待细胞长至90%，用PBS洗涤细胞3次，分别使用含有2μg/mL TPCK胰酶（HEK-293细胞不添加胰酶）的无血清DMEM稀释的H1N1、H3N2、BY、BV（MOI=0.01）感染，1小时后弃去病毒上清液，每孔加入3mL含2μg/mLTPCK胰酶的DMEM无血清培养液，34℃，5%CO2下培养，并于12、24、36、48、60小时收取上清液及RNA 和蛋白样品用于进一步实验分析。
2.2.2 Western blot
将流感病毒感染前与感染后的细胞样品与RIPA缓冲液500μL (PMSF：RIPA=1：100)混合，使用BCA定量方法进行蛋白质定量，加入4× loading buffer，然后置于100℃孵育15分钟，使蛋白质变性。在电泳仪(120V，120分钟)中，使用SDS-PAGE(7.5-15%，Bio-rad) 分离，转膜(220mA,90分钟)，5%脱脂奶粉室温封闭 2 h；将膜与一抗（1：1 000 稀释）室温孵育2小时；TBST清洗后加入 HRP 标记的山羊抗鼠IgG或山羊抗兔IgG（均 1：5000 稀释），室温孵育1小时；TBST清洗，ECL 法显色后拍照。
第三章 USP1 抑制流感病毒增殖 ................................... 12
3.1 材料 ............................................... 12
3.1.1 细胞与病毒 ...................................... 12
3.1.2 主要试剂 .......................................... 12
第四章 USP1 通过去泛素化稳定 RIG-I 蛋白表达参与抗流感病毒应答 .......................... 33
4.1 材料及仪器设备 ....................................... 33
4.1.1 主要材料和试剂 ..................................... 33
4.1.2 细胞与病毒 ........................................ 33
第五章 讨论及结论 .................................... 46
结论 ............................................ 48
第五章 讨论及结论
流感大流行严重威胁人类的生命健康和社会经济的发展，及时提供充足、有效的流感疫苗是目前各国应对流感大流行的首选方法。然而，目前流感疫苗还存在许多问题，如生产周期长、保护范围有限（不具备广谱性）、易产生过敏反应等。目前上市的流感疫苗包括流感灭活疫苗、流感减毒活疫苗和重组蛋白疫苗3种类型。由于安全性高和生产技术成熟，使得灭活疫苗是目前最常用的流感疫苗。MDCK细胞因其病毒敏感性高，不易突变，可进行大规模细胞培养并支持高产量的流感病毒生产，已在多个国家用于流感疫苗生产。近年来随着基因编辑技术的发展，人们尝试通过基因改造的方式使得疫苗生产用细胞系更符合疫苗高产的需要。例如eI F5A基因的抑制可以降低MDCK细胞中干扰素的表达促进流感病毒复制,ISG基因敲除Vero细胞中IAV病毒总颗粒产量提高了70倍，由ATCC改造的STAT1敲除细胞系可以将IAV的病毒滴度提高数十倍。因此，想要获得更多的有效基因疫苗靶点，需要我们更全面的理解感染期间病毒-宿主相互作用的分子机制。
在流感病毒入侵宿主细胞完成病毒的吸附、整合、释放的整个过程中，许多的宿主细胞病毒免疫应答基因发生改变并通过调控抗病毒等多种信号途径参与到对病毒复制的调控中，大部分基因发挥着抗病毒感染增殖功能，也有部分宿主基因可以进行抗病毒负向调控，为病毒的增殖提供有利的条件。其中，天然免疫应答是宿主细胞对抗病毒感染的重要防线，常见的宿主抗流感病毒天然免疫应答途径主要由PRRs模式识别受体介导的RLRs、TLRs、JAK-STAT、NF-kB等信号通路，同时也是利用基因工程手段改造更易于流感病毒增殖的MDCK细胞的重要靶点。一方面不仅可以提高MDCK细胞与其它疫苗生产用细胞的疫苗产量，另一方面也有望为寻找新的抗病毒靶点用于病毒感染治疗提供新思路。例如TLRs信号通路中稳定敲除IRF7的MDCK细胞能产生较高滴度的流感病毒，在贴壁或悬浮MDCK细胞中过表达siat7e基因也能产生更多的HA抗原。
结论
1、USP1可以抑制流感病毒的复制，而敲低USP1基因则显著提高流感病毒滴度。
2、过表达USP1可以增加RIG-I的K63/K48位点去泛素化，进而稳定RIG-I的表达，敲低USP1抑制了RIG-I的K63/K48位点的去泛素化，降低了RIG-I的表达。
3、USP1可以作为人工建立流感疫苗的高产MDCK细胞株的靶基因。
参考文献（略）