本文是一篇医学论文，本研究阐明了SLE BM-MSCs功能缺陷的一个重要原因，并为后续是否可以通过修饰BM-MSCs中AhR来改善SLE疾病疗效提供了一个新的思路和可能性。
第一章前言
1系统性红斑狼疮
1.1系统性红斑狼疮及致病机制概述
系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）是一种复杂的慢性自身免疫性疾病，常由遗传、环境、种族、性激素、免疫紊乱和表观遗传等多因素相互作用而引起，且好发于育龄女性，导致从轻度疲劳和关节疼痛到严重的危及生命的一系列症状[1,2]。常见的受损器官包括肾脏、皮肤、血液、心血管、神经、骨骼肌肉及肝脏等，较为特异的表现为蝶形红斑和盘形红斑等特异性皮肤损伤、狼疮肾炎和肾病综合征、关节痛和关节畸形等，并常易同其他类型的结缔组织疾病重叠或并发恶性肿瘤[3]。SLE的所有症状都并非同时出现，各种症状之间可能存在数月或数年的时间间隔。由于这种异质性的临床表现以及缺乏有效完全治愈的手段，导致SLE仍是一种疑难杂症。SLE免疫系统激活的特征是B细胞和T细胞反应过度和对自身抗原免疫耐受的丧失。抗体的产生和消除缺陷，并与体内相应的自身抗原结合形成的循环免疫复合物沉积，以及补体和细胞因子的激活引起的急慢性炎症和细胞组织损伤都会导致SLE患者体内免疫耐受异常，干扰机体正常的免疫应答，对体液免疫、细胞免疫以及补体系统均会造成影响，从而导致疾病的发生[4-6]。
多项研究表明，辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）和调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）之间的失衡是SLE发病机制的基础[7-10]。Th17细胞具有促炎作用且在SLE患者中比例较高，其含量与SLE疾病的活动性呈正相关[11,12]。而Treg细胞具有免疫抑制功能，在诱导和维持自我耐受中发挥重要作用。Treg细胞数量的降低和功能障碍与SLE的发生发展密切相关[13-15]。Th17和Treg细胞在功能和分化上是相互拮抗的。将Treg细胞注射到狼疮小鼠体内，可以控制炎症反应，减轻其病理损伤[16]。Peng等人检测了确诊为干眼综合征（Dry eyesyndrome,DE）的SLE患者的泪液样本，分析了Th17细胞相关细胞因子，包括白介素（Interleukin,IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-17F、干扰素（Interferon,IFN）-γ和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α等，发现Th17表达通路在SLE患者中调控异常[17]。
2间充质干细胞
2.1间充质干细胞及免疫调节功能概述
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）属于多能干细胞，最初从骨髓基质中分离出来，也可从脐带、脂肪、外周血、肝脏、牙根等多种组织中分离得到[27,28]。MSCs具有多向分化潜能和强大的免疫抑制能力，在体外它们可以被诱导分化为中胚层细胞系，如脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞等，有趣的是，它们还具有分化成外胚层或内胚层细胞系的潜力[29,30]。MSCs可以调节T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，这种作用通常通过直接接触和改变局部微环境来完成，多种细胞因子也参与其中[31-33]。MSCs和T细胞之间的相互作用已被深入研究，在不同模型中均显示MSCs能有效抑制T细胞的增殖，此外，人骨髓来源的MSCs在体外也能有效抑制T淋巴细胞的增殖[34,35]。同样的，人和小鼠的MSCs也能抑制B细胞的活化、增殖和分化。多项证据表明，B细胞与MSCs共培养后出现细胞周期阻滞、浆细胞生成受损、免疫球蛋白分泌能力受损和趋化特性降低等表现[36-38]。体外研究发现，MSCs及其培养上清2间充质干细胞2.1间充质干细胞及免疫调节功能概述间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）属于多能干细胞，最初从骨髓基质中分离出来，也可从脐带、脂肪、外周血、肝脏、牙根等多种组织中分离得到[27,28]。MSCs具有多向分化潜能和强大的免疫抑制能力，在体外它们可以被诱导分化为中胚层细胞系，如脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞等，有趣的是，它们还具有分化成外胚层或内胚层细胞系的潜力[29,30]。MSCs可以调节T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞，这种作用通常通过直接接触和改变局部微环境来完成，多种细胞因子也参与其中[31-33]。MSCs和T细胞之间的相互作用已被深入研究，在不同模型中均显示MSCs能有效抑制T细胞的增殖，此外，人骨髓来源的MSCs在体外也能有效抑制T淋巴细胞的增殖[34,35]。同样的，人和小鼠的MSCs也能抑制B细胞的活化、增殖和分化。多项证据表明，B细胞与MSCs共培养后出现细胞周期阻滞、浆细胞生成受损、免疫球蛋白分泌能力受损和趋化特性降低等表现[36-38]。体外研究发现，MSCs及其培养上清
第二章材料与方法
1实验仪器和材料
1.1实验仪器与设备
2实验方法
2.1 BM-MSCs分离、培养及鉴定
2.1.1细胞的分离和培养
全骨髓贴壁法分离小鼠BM-MSCs：根据文献所述[106]分别将C57小鼠和MRL/lpr小鼠置于密闭容器中，向其中加入CO2，待小鼠窒息后，迅速用颈椎脱臼法将其处死。在烧杯中用70%乙醇浸泡小鼠5分钟后，放入超净工作台的100毫米无菌培养皿中，用高压灭菌后的手术刀、眼科剪和镊子切开小鼠腹股沟皮肤，分离出完整的小鼠胫骨和股骨。用微型解剖剪刀和镊子去除胫骨和股骨上附着的肌肉、肌腱和软组织，在进一步处理之前，将骨头保存在添加了双抗的PBS溶液中，冲洗三次。剪刀剪开胫骨和股骨的两端，用含有针头的注射器吸取约2-3mL的α-MEM完全培养基冲洗骨髓腔，至少彻底冲洗骨髓腔三次，直到其变白为止。将冲洗出的细胞混合物用注射器轻轻混匀，使用70μm的细胞滤网过滤去除体积较大的细胞（如红细胞等）后800rpm离心5min，用新鲜配制的5mLα-MEM完全培养基吹打重悬后接种到25cm2的透气细胞培养瓶中，放入37°C、湿润的含有5%CO2的细胞培养箱中进行贴壁筛选培养。48小时后半量换液，去除一定比例的非贴壁细胞，之后每三天全量更换一次培养基连续培养。当细胞生长至80%-90%融合时传代，用0.25%胰酶消化细胞，待其变圆后加入α-MEM完全培养基中和，吹打收集细胞后800rpm离心5min，去除离心后的上清液，加入5mLα-MEM完全培养基并用移液枪重悬混匀，接种于新的25cm2透气细胞培养瓶中培养。经过2~3次消化传代后，绝大多数杂细胞被去除，第四代（P4）的细胞将用于后续实验。
第三章实验结果................................26
1小鼠BM-MSCs的分离、培养及鉴定..........................26
1.1 BM-MSCs的分离和培养.............................26
1.2 BM-MSCs表面标志物鉴定................................26
第四章讨论..............................45
第五章结论......................................48
第四章讨论
SLE以机体自身组织的异常免疫反应为特征，导致免疫耐受崩溃、局部组织破坏和慢性炎症[109]。MSCs由于其强大的免疫调节功能和再生能力，成为了治疗SLE的有利候选者。MSCs能从多个组织中获取，但它又以在骨髓中含量最多，相比于其他的MSCs，人BM-MSCs的获取只需要骨髓穿刺即可，造成的创伤也较小[110]。BM-MSCs作为骨髓微环境的重要一员，对免疫平衡的维持也至关重要。但有研究表明BM-MSCs治疗对部分SLE患者效果不佳，这与SLE患者BM-MSCs存在缺陷及SLE患者体内复杂的微环境有很大的关系[56,57]。本研究以经典的SLE自发模型MRL/lpr小鼠作为研究载体，C57小鼠作为对照，两种小鼠的BM-MSCs作为核心，深层次探讨SLE BM-MSCs存在缺陷的具体机制，并观察AhR配体FICZ对MRL/lpr小鼠发病及BM-MSCs免疫调节功能的影响，为BM-MSCs治疗SLE的疗效提供新的理论依据。
在本研究中我们从C57小鼠和MRL/lpr小鼠的骨髓中获取了BM-MSCs，利用全骨髓贴壁法经过不断传代去除杂细胞，纯化得到生长状态良好的BM-MSCs。但单从显微镜观察无法辨别确认细胞的特异性，BM-MSCs的鉴定还需要表面标志物和多向分化能力检测。根据国际细胞治疗学会和文献所述[106]，我们选取了Sca-1和CD29作为BM-MSCs的阳性表达抗原，CD34和CD11b作为阴性表达抗原，用流式细胞术对分离纯化出的细胞进行了鉴定。而BM-MSCs在β-甘油磷酸钠、地塞米松和维生素C的作用下，随着时间变化会逐渐形成矿化结节并能被茜素红S染色显现出，证实BM-MSCs具有向成骨方向分化的能力[29]。另一方面通过IBMX、罗格列酮、地塞米松和牛胰岛素处理后的BM-MSCs会逐渐形成脂滴，并被油红O染色观察到，证实其也具有向成脂方向分化的能力[29]。通过对细胞形态、表面抗原分子以及多向分化潜能的检测，证实我们分离纯化的细胞即为BM-MSCs，且从C57小鼠和MRL/lpr小鼠中分离得到的BM-MSCs最基本的干细胞特性并无差异。
第五章结论
1.AhR在MRL/lpr小鼠BM-MSCs中高表达，且其可介导BM-MSCs免疫调节功能障碍。
2.AhR配体FICZ可通过激活AhR影响MRL/lpr小鼠的发病进程。
3.AhR配体FICZ可激活AhR并通过YAP蛋白介导BM-MSCs免疫调节障碍。
参考文献（略）