本文是一篇医学论文，本研究表明bLF在体外具有明显的抗A549细胞活性，但bLF对A549细胞的抑制作用还未详细揭示，bLF的抗肺癌机制还需进行更多的实验挖掘，后续体内抗癌作用后期还需进一步深入研究，这些问题将是未来研究的重点。
第一章文献综述
1肺癌及其研究现状
肺癌是肺部病变细胞“有增无减”增殖后形成的瘤体，其发病率和死亡率较高且呈现持续不断增长的趋势[1]。根据全球癌症统计数据显示，每年约有超过200万人被新诊断为肺癌[2,3]；其中约有一半在亚洲[4]。在过去的几年里，中国的肺癌发病率和死亡率一直呈上升趋势[5]。根据国际癌症研究机构报告的统计显示，仅2020年，中国约有82万新确诊肺癌患者和71.5万肺癌相关死亡病例。并且，据专家推测，各国肺癌新发病例数将持续上升[3]。作为高危性恶性肿瘤的代表，肺癌不仅存在于人类，在动物中也频发，也是导致动物死亡的主要危险因素之一。因此研究肺癌的防控与治疗，对于保护人/畜安全具有重要意义。
肺癌可分为两种主要亚型：非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)。其中，NSCLC占总肺部肿瘤病例的85%[6]。近几十年来，不同分子靶点的发现使得针对NSCLC的靶向治疗成为热点。尽管取得了诸多进展，但由于肺癌的早期发病症状不明显，多与肺结核、肺炎等疾病表现特征相同，因此易导致患者忽视病情[7]。而癌细胞突破正常细胞的“生命规律”，在体内增殖的速度迅猛，多数肺癌患者确诊时已进入疾病的进展期或晚期，此时治愈性手术选择有限，NSCLC患者的五年平均生存率仅为23%-27%[1]。近年来，微创技术在利用胸外科手术治疗早期肿瘤方面取得了许多进展，但局部肿瘤患者的五年生存率仍仅为64%，这表明尽管这些肿瘤被诊断为早期阶段，但其侵略性仍不可忽视。而当NSCLC到晚期时，大多数患者会出现合并症，此时可使用的手术方法会受到极大限制。此外，超过70%被诊断为NSCLC的患者存在局部或转移性淋巴播散，使其五年生存率分别下降到7%和33%[8]。
1.2肺癌的治疗方法
肺癌治疗需进行多方面评估。首先应充分了解患者状态、肿瘤的病理分型和肿瘤分期等情况，再采用多模式、综合化治疗方式，从而减轻患者的临床症状，提高其健康状况，并在一定程度上遏止病情恶化，延长患者生命。目前肺癌的治疗手段主要有手术、放疗、化疗、靶向治疗及免疫治疗等[20]。
1.2.1手术切除
手术切除被认为是治疗NSCLC的基石，也是局部疾病控制的最佳形式，一般分为局部和扩大切除两类，应根据患者病情选用适当方法，在肺癌早期，手术切除治疗能达到预期的治疗效果[24]。研究表明，早期肺癌患者手术去除癌变体后的五年生存率可接近五成以上。虽然局部治疗取得了阶段性成功，NSCLC的术后复发率仍然很高，这和癌细胞的分子特征、生长特性和癌症的发展情况以及微环境等因素有关[25]。因此，尽管手术治疗方式在NSCLC中发挥重要作用，但外科手术在诸多方面尚不够稳定，因此亟需找到更优异的替代性或辅助性治疗方案，以治愈或延长患者的生命。
1.2.2化疗
化疗是化学药物治疗的简称，其治疗方法是根据病情的不同来采选合适的化疗药物，通过口服或静脉注射途径将药物运输至患处，达到杀伤和抑制癌细胞增殖的效果，是治疗癌症中极为关键的步骤。基本上，化疗是晚期或不可切除的NSCLC患者，尤其是SCLC患者的首选治疗方案[26,27]。化疗药物主要有以下四大类：(1)烷化剂(例如顺铂和卡铂等铂类化合物)；(2)微管靶向药物(例如紫杉醇、多西他赛和长春瑞滨)；(3)抗代谢药物(例如培美曲塞和吉西他滨)；(4)拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷)[28]。这些药物可通过细胞毒性作用，杀伤所有快速分裂的细胞。
第二章bLF对A549细胞增殖及迁移的影响
1实验材料
1.1细胞系
人胚肺成纤维细胞MCR-5、幼仓鼠肾传代细胞BHK-21由生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室保存并提供；人肺腺癌细胞A549由兰州民海生物工程有限公司惠赠。
1.2主要药品
牛乳铁蛋白(Bovine lactoferrin,bLF)，购自成都麦克林生物科技有限公司，用无菌纯水配制成浓度为50mg/mL储液，并于-80℃保存。
2实验方法
2.1细胞培养
(1)取出液氮中保存的BHK21、MRC-5和A549细胞，在37℃水浴中快速解冻(管口保持在水面上方)，800 r/min低转速离心5 min后，弃去冻存液。
(2)将MRC-5和A549细胞转移至含10%FBS的F12完全培养基中，BHK21细胞转移至含10%FBS的DMEM完全培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养12 h，在倒置显微镜下观察细胞是否开始贴壁生长，待细胞贴附到瓶壁上后，更换一次培养基，然后继续培养，直到细胞生长密度至85%以上时进行传代。
(3)弃去原有细胞培养液，加入2 mL无菌1×PBS洗涤细胞两次，加入2 mL胰蛋白酶，培养箱静置消化1 min，当观察到细胞处于流沙状脱落时，加入5 mL完全培养基，使用无菌吸管反复吹打培养瓶内壁，使细胞充分脱落分离，按所需细胞数移至新的细胞瓶中并继续培养。
2.2细胞计数
(1)在进行血球计数之前，为避免在计数过程中出现误差，先通过显微镜观察计数板中的计数室，如发现有杂物或污垢，需要使用酒精进行清洗，并待其晾干后才能使用。
(2)在上述干净的血球计数板上，盖上配套盖玻片，然后用移液枪吸取适量稀释后的细胞悬液，小心地滴入盖玻片下方，让培养液缓慢渗透进计数室。该过程需特别注意避免产生气泡，以确保得到准确的计数结果。
(3)当细胞都沉淀到计数室底部时，将计数板放在显微镜载物台的中间位置，并按照以下公式进行计数：细胞悬液细胞数/ml＝4个大正方形内之细胞数目之和×稀释倍数×104)/4。注意，对于处于边界位置的细胞，为得到最准确的血球计数结果，只需要计算上边界和左边界处细胞，或计算下边界和右边界处细胞。
第三章 bLF调控A549 细胞凋亡的作用机理初探 ............................. 33
1 实验材料 .......................... 33
1.1 细胞系 .......................... 33
1.2 主要药品 .................. 33
第四章 结论............................... 44
第三章bLF调控A549细胞凋亡的作用机理初探
2实验方法
2.1细胞培养参照第二章2.1部分。
2.2 Hoechst 33342细胞核染色
将生长状态良好的A549细胞制成悬液，调整细胞密度为3×105个细胞/mL，在6孔板中每孔接种1 mL细胞悬液，12h后，分别用0.5,1.0和1.5 mg/mL浓度的bLF分别处理细胞24 h，小心去除原细胞液，用1×PBS清洗6孔板细胞并其余清洗液，各孔分别加入1 mL 4%多聚甲醛，室温固定20 min，弃掉固定液，1×PBS清洗两遍，加入适量Hoechst 33342染色液没过细胞，37℃染色20 min，弃去染色液，1×PBS洗涤细胞3次，避光环境在荧光显微镜下观察细胞染色情况，并拍照记录。
2.3流式细胞术检测细胞凋亡
将生长状态良好的A549细胞制成悬液，按照3×105个细胞/孔均匀地接种于6孔板培养过夜，待细胞贴附且达到70-80%的汇聚度后。小心去除原培养基，用预冷的1×PBS温和清洗细胞，以去除漂浮细胞。随后加入不同浓度的bLF(终浓度分别为0,0.5,1.0和1.5 mg/mL)继续孵育24 h。24 h后使用适量胰蛋白酶对孔内细胞进行消化，并随时观察细胞直至消化完全，弃去孔内胰蛋白酶，加入2mL完全培养基轻柔吹打并转移细胞悬液于新的无菌2 mL收集管中。低速离心10 min(1,000 rpm/min)，弃去上清液，并用预冷的无菌1×PBS重悬细胞，再次低速离心10 min，此过程重复2次。用含有膜联蛋白V-FITC和PI的缓冲液重悬细胞沉淀，轻柔混匀后，在避光条件下室温反应15 min，之后转移至流式细胞检测试管中完成上机检测，收集并分析数据。使用GraphPad Prism 8软件绘制统计柱状图。
第四章结论
bLF作为一种抗癌活性较高的天然蛋白，对肺癌A549细胞生长的抑制作用机制尚不清楚。本论文以肺癌A549细胞为模型，体外细胞实验初探了bLF抑制A549的分子机制。具体结论如下:
(1)bLF对A549细胞具有较强的杀伤效果，可抑制A549细胞的克隆形成，且其毒性作用呈现浓度依赖性。
(2)bLF通过调控周期相关蛋白及因子，将A549细胞周期阻滞在S期，且S期比例随着bLF浓度的增加而升高。
(3)bLF可通过调控部分迁移相关因子，进而抑制A549细胞的迁移能力。
(4)bLF上调P53基因并增强了促凋亡蛋白Bax与Caspase3的表达，同时抑制了抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，以促进A549细胞发生凋亡。
(5)bLF增强了A549细胞内ROS浓度，激活线粒体凋亡途经从而诱导A549细胞发生凋亡。综上，本研究表明bLF在体外具有明显的抗A549细胞活性，但bLF对A549细胞的抑制作用还未详细揭示，bLF的抗肺癌机制还需进行更多的实验挖掘，后续体内抗癌作用后期还需进一步深入研究，这些问题将是未来研究的重点。
参考文献（略）