本文是一篇医学论文，笔者通过对睾丸组织的RNA-seq发现，LDNR-Ctr组和LDNR-Al组中Tfg基因表达量在LDNR-Al组中被显著下调。因此，Tfg未来有可能作为一个有价值的候选基因，用于弱精症的诊断或治疗方案中。与激素高度相关的基因集分析也为进一步深入研究铝暴露影响内分泌系统的分子机制提供了丰富的线索。
第一章 文献综述
1铝暴露与弱精症的联系
1.1 弱精症的概述
全世界约1.86亿人受不孕不育影响[1]，不孕不育症已逐渐成为了仅次于心脑血管疾病与癌症之后影响人类健康的世界第三大疾病，成为全球生殖健康的一个重要问题。随的全球不孕不育发病率逐年上升，估计每6对夫妇中就有1对患有不孕不育症，给育龄夫妇带来了极大的精神和经济负担[14,15]。男性因素被认为是主要原因之一，据WHO统计以及流行病学显示：目前全世界大约有15%的育龄夫妇存在不育问题，大约50%的不孕症病例是由男性因素引起的[16]。随着全球范围内男性不育的持续增加，它已成为一个引起临床更多关注的重大健康问题。许多男性不育病例仅表现为精子浓度或精子活力降低，由于缺乏明确的临床原因，被诊断为特发性少精子症或弱精子症[17,18]。弱精子症（AS）是人类男性不育的常见原因之一，其特征是精子活力<50%或进行性活力<25% [19]。因参与精子运动的正常生理学的蛋白质相当稀少，弱精子症的分子基础尚未完全了解[20,21]。
弱精症临床上尚停留在较低的诊断水平和治疗方式，这主要是由于精子活力下降的病因十分复杂，与感染、精液液化异常、内分泌因素、免疫因素、遗传性因素等多种因素有关[9,22]。目前大多数治疗弱精子症的药物缺乏特异性和理想的治疗效果，深入了解弱精子症的发病机制对于开发针对这种疾病的特定疗法非常重要。
2 模式动物内分泌轴的动态变化
2.1 模式动物的概述
金色仓鼠（也称叙利亚仓鼠，Mesocricetus auratus）是一种季节性繁殖动物，其性腺在春夏两季的长光照中发挥功能，在秋冬两季的短光照中萎缩。因此垂体-睾丸轴的功能每年都会发生周期性变化（图1-1）。这种季节性繁殖节律可以在一年中的任何时候，通过人工改变光照量在该物种的实验室种群中引起。成年雄性仓鼠暴露于短白天（SD：L8：D16，即8小时光照：16小时黑暗）会诱导睾丸自然萎缩，睾丸间质细胞退化和数量减少。通常伴随着血清促卵泡激素（FSH）、黄体生成素（LH）、催乳素（PRL）和睾酮水平的显著降低，性腺显著退化[44,45]，精子发生也会中断[46-48]。当饲养于长白天（LD：L16：D8，即16小时光照：8小时黑暗）时，睾丸会恢复成正常大小，血清激素水平以及内分泌功能和精子发生也会恢复[45,49,50]。金毛仓鼠与实验室常用的其他啮齿类动物（如小鼠）的区别在于，它们的生精活动具有明显的季节性周期，并且能够通过将动物暴露于短（抑制性）或长（刺激性）光照条件中，在实验室中“关闭”或“开启”生精活动。利用这种具有在不同光周期下能自发引起睾丸萎缩或恢复的特殊模型，并在这一过程进行三氯化铝暴露。这样就可以在天然的睾丸萎缩（精子生成受阻）或恢复（精子生成恢复）的过程中，观察生命节律调控的内分泌轴是否受到铝暴露的影响，以及这些影响是否进而损害生殖系统靶器官（睾丸）功能。
第二章 三氯化铝暴露对体外细胞理化性质的影响
1 实验材料
1.1 实验对象
SPG-GC1细胞系（中国科学院上海生命科学院细胞库）
1.2 主要仪器与设备
1) 轨道式振荡器（杭州奥盛仪器有限公司） 2) 微型离心机（杭州奥盛仪器有限公司） 3) 生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司） 4) 细胞培养箱（美国Thermo公司） 5) 0.22 μm超滤管（美国Millipore公司） 6) 全自动酶标分析仪（AMR-100）（杭州奥盛仪器有限公司） 7) -80℃超低温冰箱（美国Thermo公司） 8) 数显恒温水浴HH-S2（江苏金坛医疗仪器公司） 9) 微量移液器（美国Eppendorf公司） 10) 体视显微镜SMZ1500（日本NIKON公司） 11) Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司） 12) 立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50KBS（上海申安医疗器械厂） 13) FA2004电子天平（上海良平有限公司） 14) 12孔、96孔细胞培养板（德国Greiner Bio-one公司）
2 实验方法
2.1 细胞的培养
1) 细胞复苏：将10ml 10% FBS细胞培养液放于细胞培养箱中30 min。打开水浴锅，预热到37℃后，将冻存管细胞迅速置于水浴锅中解冻，解冻后加入预热的培养液中。从细胞培养皿中吸出1 ml培养液润洗冻存管，然后将润洗液吸入到培养皿中，2 h后进行换液，洗掉未贴壁的死细胞。
2) 细胞换液：养细胞时，若发现培养基颜色变黄或者刚复苏细胞2 h，则需要更换培养液。做好仪器消毒灭菌工作后，将细胞从培养箱中取出，放置超净台上。用无菌枪头移走需要更换的培养液，吸取10 ml新鲜培养液，沿着培养皿侧面缓慢打入，注意不要用力或对细胞直接吹打，防止细胞脱落。
3) 细胞传代：待细胞长到80%-90%，吸出培养液弃掉。加入1 ml 0.05%胰酶，左右晃动培养皿，使胰酶浸润整个培养皿底部，放入培养箱消化2 min。放置显微镜下观察，待细胞形态变圆，细胞间隙变大，细胞胞质回缩，加入适当培养液终止消化。反复吹打细胞使其从底部脱落，混匀后吸取适量体积的细胞至新的培养皿中。
4) 细胞冻存：吸出培养液弃掉，加入1 ml 0.05%胰酶，左右晃动培养皿，使胰酶浸润整个培养皿底部，放入培养箱消化2 min。待到细胞形态变圆后，加入适当培养液终止消化，反复吹打混匀，吸至15 ml离心管，1000 rpm，5 min，弃上清，加入适量冻存液，分装至细胞冻存管，-20℃，2 h，-80℃，过夜，转入液氮保存。
第三章 建立光周期背景下的铝暴露金毛仓鼠模型 .......................... 17
1 实验材料 ......................... 17
1.1 实验对象 ...................................... 17
1.2 主要仪器与设备 ............................... 17
第四章 铝暴露导致细胞内MAR活性水平增高和MAR修饰蛋白在细胞中聚集 .......................... 26
1 实验材料 .................... 27
1.1 实验对象 .................................................. 27
1.2 主要仪器与设备 .................................... 27
第五章 三氯化铝暴露对内分泌轴激素的影响 ............................. 34
1 实验材料 .................................... 34
1.1 实验对象 ............................................. 34
1.2 主要仪器与设备 ............................... 34
第六章 睾丸组织的RNA-seq分析
1 实验材料
1.1 实验对象
第三章所取的睾丸
1.2 主要仪器与设备
部分同第三章
1) 无RNA酶的10 μl，200 μl和1000 μl枪头（江苏海门佳卫玻仪厂） 2) 无RNA酶的0.2 ml，0.5 ml，1 ml和2 ml EP管（江苏海门佳卫玻仪厂） 3) 实时荧光定量PCR仪（美国赛默飞世尔科技公司） 4) 基因扩增仪（美国赛默飞世尔科技公司） 5) 微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）
1.3 主要试剂
1) Trizol（美国Ambion公司） 2) 异丙醇（上海生工生物股份有限公司） 3) 无水乙醇（上海生工生物股份有限公司） 4) Ribo-Minus 试剂盒（美国Life Technology公司） 5) RNA fragmentation试剂盒（美国Ambion公司）6) HiScript II Q RT SuperMix （R223-01）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司） 7) ChamQ SYBR qPCR Master Mix for qPCR （Q321-02）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）
结论与展望
通过构建金毛仓鼠这种具有在不同光周期下能自发引起睾丸萎缩或恢复的特殊模型，在天然的睾丸萎缩（精子生成受阻）或恢复（精子生成恢复）的过程中进行三氯化铝暴露，进而将铝暴露对生命节律调控下的内分泌系统和生殖系统的损伤联系起来。观察光周期变化过程中，生命节律调控的内分泌轴是否受到铝暴露的影响进而对生殖系统靶器官（睾丸）功能造成损害。对这一过程中主要光周期节点的样品进行高通量全转录本测序筛查，寻找治疗铝暴露导致弱精症的新靶点，结果如下：
1、三氯化铝暴露对SPG-GC1细胞的影响：通过CCK8实验和划痕实验发现，铝暴露会抑制生殖细胞的增殖和迁移能力，并且随着浓度的升高，抑制作用越明显。
2、三氯化铝暴露对体内精子结构的影响：通过对仓鼠的精子制片观察发现，铝暴露会明显提高精子的畸形率，也会引起精子细胞核浓缩现象。对SPG-GC1细胞的MAR信号检测：因三氯化铝的暴露导致精子细胞核浓缩，经查文献发现PARP家族蛋白活性的改变，会引起细胞核和精子结构异常，我们发现铝暴露确实提高了细胞内蛋白的MAR基化水平。
3、铝暴露对内分泌轴的激素影响：短光照过程中，SDR-Al组血清中醛固酮水平明显低于SDR-Ctr组，SDR-Al组睾丸中肾上腺酮水平也明显低于SDR-Ctr组；在长光照恢复过程中，LDR-Al组睾丸中双氢睾酮、孕酮和表雄酮水平明显低于LDR-Ctr组，LDNR-Al组睾丸中雌三醇和雌酚酮水平也明显低于LDNR-Ctr组，但是LDNR-Al组血清中表雄酮水平显著高于LDNR-Ctr组。
参考文献（略）