本文是一篇医学论文，笔者认为心血管疾病患者血浆外泌体中差异表达基因的表达趋势与外周血白细胞不完全一致。其中SGK3 mRNA在CHD患者血浆外泌体中表达上调，在外周血白细胞中表达下调。SGK3可能通过增加LDL摄取和胆固醇蓄积在CHD的发生发展中发挥重要作用。这项工作为SGK3在CHD的病因学研究提供了新的证据。
二、材料试剂与仪器
1. 主要材料与试剂
1.1 细胞培养相关材料与试剂
1.本实验所用的THP-1细胞，HepG2，Huh7，LO2肝细胞均购自美国 ATCC 细胞库。
2.本实验所用混合高脂血清来源：从湖北省十堰市太和医院收集10名同时患有CHD和高脂血症（TC≥5.7mmol/L，TG≥1.7mmol/L）患者的血清进行混合，并用0.22µm 过滤器过滤备用。混合后的高脂血清脂质代谢标志物检测值见表2.1。
2. 主要仪器
三、实验方法
1. 血浆外泌体 mRNA的高通量筛选
1.1 研究对象纳入标准
经过湖北医药学院附属太和医院医学伦理委员会批准，获得研究对象知情同意后，于2018年6月在该医院招募5例经冠脉造影提示ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者以及3例冠脉造影显示阴性的健康体检者，采集外周血。STEMI 患者的纳入的标准为：血清学检测提示心肌损伤标志物异常增高；心电图显示相邻两个或两个以上导联ST段抬高，新发或疑似新发左束支传导阻滞。排除标准为：患有先天性心脏病及其他心血管疾病、炎性疾病、恶性肿瘤、以及使用免疫抑制剂或者化疗药物。这两组研究对象性别、年龄相当，且均无高血压、糖尿病、高脂血症病史。
1.2 血液标本采集
用含有EDTA 抗凝剂的采血管在患者入院6小时内采集外周血，缓慢混匀后存于4℃冰箱静置24小时，在5000rpm条件下离心 5min。用移液器缓慢吸取血浆到2mL无酶的EP管中后保存于-80℃冰箱用于后续实验。
1.3 血浆外泌体提取
将上一步保存的超低温冷冻血浆取出平衡至室温，并将其转移至 10mL 离心管中，并向管中加入3倍体积的提取试剂；缓慢混匀混合液后将其在4℃冰箱中静置30min；将静置好的溶液在4℃，15000 g条件下离心5min;小心吸弃上清液后重复离心一次，提取的外泌体用于后续实验。
2. 外泌体差异表达的基因在外周血白细胞的表达情况检测
2.1 研究对象纳入标准
在2019年6月至2020年9月，在湖北省十堰市太和医院收集293例CHD患者以及272名非CHD健康体检者已完成常规检测的残余外周血样本。由于样本量有限，我们选择了更容易获取的外周血白细胞提取总RNA，进行基因表达检测。CHD患者的纳入标准, 排除标准依据[34]。纳入标准：所有CHD参与者经冠脉造影检查，结果提示阳性，并且经临床医师诊断确诊为CHD。排除标准：患有先天性心脏病及其他心血管疾病、炎性疾病、恶性肿瘤、以及使用免疫抑制剂或者化疗药物。非CHD对照者均为健康体检者，无CHD相关病史及体征。研究对象血压≥140/90mmHg被定义为高血压；空腹血糖≥7mmol/L，餐后2小时血糖≥11mmol/L被定义为糖尿病；TC≥5.7mmol/L，TG≥1.7mmol/L被定义为高脂血症。本研究依据1975 年《赫尔辛基宣言》的伦理指南进行，并经过湖北省十堰市太和医院医学伦理委员会批准，所有研究对象在纳入研究前均知情同意。
2.2 血液标本收集
收集已完成常规检测的残余外周血样本，缓慢混匀后在室温，5000rpm条件下离心 5min。用移液器吸取上层血浆到2mL无酶的EP管中，保存于-80℃冰箱用于后续实验。下层血细胞立即用于白细胞总RNA提取。
2.3 临床生化指标检测
本实验共选取了5个与CHD关系密切的生物标志物进行检测。包括甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和葡萄糖。所有生物标志物均在湖北省十堰市太和医院检验中心检测。
三、实验方法 ................................................. 19
1. 血浆外泌体 mR NA的高通量筛选 ................................. 19
1.1 研究对象纳入标准 ................................... 19
1.2 血液标本采集 ............................................. 19
四、结果 ................................. 30
1.差异表达基因在临床样本中的表达水平 .................... 30
1.1 STEMI 患者血浆外泌体 mRNA 微阵列分析结果 ............................. 30
1.2 外泌体差异表达的基因在外周血白细胞的表达情况检测 ................. 31
五、讨论 .................. 42
五、讨论
尽管越来越多的研究人员参与心血管疾病的研究，但心血管疾病仍然具有较高的发病率和死亡率[35-38]。CHD是多种心血管疾病的病理基础，有多种发病风险因素，如血脂异常、高血压、糖尿病、炎症和免疫细胞反应等[39-41]。目前CHD的发病机制尚不完全清楚，传统的诊断和治疗方法十分有限。因此寻找有效的诊断标志物以及药物作用靶点对于疾病的防治尤为重要。
随着新型检测技术和分析方法的应用，一些与疾病相关的靶分子研究为心血管疾病的病因和机制研究提供了新的思路。在本研究的第一部分，我们对CHD患者血浆外泌体 mRNA 进行转录组测序分析，发现了大量差异表达的mRNAs，并在外周血白细胞中检测差异基因的表达情况，分析差异基因与CHD的相关性。这些基因在CHD患者外周血中的表达情况目前鲜有报道，这一研究为CHD的诊断和治疗提供了新的依据。
脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化的关键因素，在过多的脂蛋白作用下，激活的内皮细胞分泌大量的炎症因子，单核细胞经刺激形成巨噬细胞后清除体内过多的胆固醇。吞噬脂蛋白的巨噬细胞早期演变成泡沫细胞，继而发展成为脂肪条纹和粥样斑块[42, 43]。因此，在本研究中我们主要从脂质代谢的角度探究差异表达基因与CHD的联系。由于时间限制，在本研究的第二部分，我们选择了在外泌体和外周血白细胞中表达趋势不一致但都有显著性差异的基因SGK3进行体外研究，探究SGK3在脂质代谢调控中的作用。
六、结论
1、在STEMI 患者和健康对照组血浆外泌体中共筛选出194个差异表达基因， 其中表达上调的基因有173个，表达下调的基因有21个，为后续实验奠定基础。
2、与健康对照者相比，SGK3、RPL34、MAP6D1、PPP2CB mRNA在CHD患者外周血白细胞中低表达；RPS12在CHD患者外周血白细胞中高表达。
3、SGK3 mRNA的表达水平与TC、HDL-C、LDL-C含量呈正相关；RPL34、MAP6D1、PPP2CB的表达水平与TC的含量呈显著正相关；RPS12的表达水平与TG的含量呈显著正相关。
4、SGK3、RPL34、MAP6D1、PPP2CB的低表达是CHD的独立风险因素；RPS12的高表达也是CHD的独立风险因素，与性别、年龄、高脂血症、糖尿病及高血压等危险因素无关。
5、与对照组相比，混合高脂血清刺激可上调THP-1细胞和HepG2、Huh7、LO2肝细胞中SGK3 mRNA和蛋白表达水平。
6、SGK3受到混合高脂血清刺激后可能增加LDL摄取和胆固醇蓄积，SGK3可能是脂质代谢调控的关键基因。
参考文献（略）