本文是一篇医学论文，本研究探讨PBRM1在ccRCC中的生物学功能，寻找在ccR CC中可能被PBRM1所调控的基因和影响的通路，尤其是编码糖酵解相关代谢酶的基因和影响糖酵解的通路。
1 材料与方法
1.1 细胞与来源
1.2 主要实验试剂及工作液配制
1.2.1 主要实验试剂
2 方法
2.1 细胞培养
（1） 细胞复苏
实验前准备，紫外光照射生物安全柜至少30min。在15mL离心管中首先加入5mL的培养基。于-80℃冰箱或者液氮罐中将细胞快速取出，用薄膜手套包好，于37℃水浴锅快速旋转1分钟解冻，直至冻存管无冰晶。室温，800rpm离心5min后，移除上清液，细胞沉淀用1mL完全培养基重悬，吹打混匀后接种至培养瓶中。将培养瓶放入37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。第二天，镜下观察细胞生长情况，弃去瓶中原来的培养液，PBS清洗一次，换用新的完全培养基继续培养。
（2） 细胞传代
当细胞贴满培养瓶底，密度约为90%左右时，先将胰酶、PBS置于培养箱中预热。实验前准备同细胞复苏步骤一致。弃去培养瓶中的原培养液，PBS清洗2次，加入预热的适量的胰酶消化，镜下观察当细胞回缩变圆、透亮时，立即加入2mL培养液终止消化。室温，800rpm离心后吸去上清，重悬细胞沉淀，用移液管上下吹打混匀后，依据细胞数量可按1：2~1：5进行传代，每瓶均加入5mL培养液进行培养。
（3） 细胞冻存
在冻存管上做好标记（标注名称、代数、日期、冻存者姓名），按细胞传代的方式将细胞消化离心后，用冻存液重悬细胞沉淀，用吸管吹打混匀后吸至冻存管中，1.5mL/管。将冻存管放入梯度降温冻存盒中，放于-80℃冰箱中过夜。最后将细胞冻存管取出于-80℃冰箱短期存放或液氮罐中长期保存。
（4） 细胞计数
按细胞传代的方式将细胞消化下来后，将待测细胞离心，弃去上清后用1mL培养液将细胞沉淀重悬混匀后，取10μL从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘加入（或者可以先取10μL加入90μL培养基稀释10倍后再取10μL进行计数），注意保证盖玻片下充满悬液，勿产生气泡。静置1min，在显微镜下观察并计算四大格细胞之和（压线边缘细胞只计上方和左侧）。按以下公式计算：细胞密度（个/mL） =（四大格细胞之和/4）×104个/mL。
2.2细胞siRNA转染
本课题组从上海吉玛公司先后订购了5条PBRM1 siRNA及其对照siRNA。将siRNA转染到786-O细胞内，然后利用Western Blot和qRT-PCR技术检测siRNA敲减效果，利用敲减效果较好的siRNA进行后续性实验。最后得出siPB1-2敲减效果较好，其序列信息如下：Forward：5'-GCACCAAAGCGAAGAAAUC-3'，Reverse：5'-GAUUUCUUCGCUUUGGUGC-3'。 786-O细胞和SN12C细胞均按以下步骤操作：
第一天，按细胞传代方式消化离心细胞后，用无双抗培养基接种6×105个细胞/孔于6孔板中。
第二天，细胞密度约为60%时进行转染。配制转染复合物：先取若干个0.2mL的无酶EP管，其中一部分EP管内分别加入50μL Opti-MEM培养基，再分别加入 20μM阴性对照（Negative Control，NC）8μL，20μM siPB1 8μL，移液器混匀，做好标记静止5min；再取1个无酶1.5mL管，先加入适量（6孔板每个孔需要每种siRNA 体积为50μL）Opti-MEM培养基，再加入适量（6孔板每个孔的每种siRNA需要8μL）siRNA mate，移液器混匀，静止5min；将siRNA mate的混合物57μL 分别加入含siRNA混合液的0.2mL管中，移液器混匀，室温静置20min。将含有细胞的6孔板孔内分别换上预热的无双抗3%血清的培养基1.9mL。将上述复合物分别加入6孔板中并分别做好标记。8h后换上含双抗的10%血清完全培养基。
转染48h后提取总RNA，或转染72h后收集细胞提取总蛋白检测敲减效率。
结果…………………………..21
讨论…………………………..48
结论………………………………..53
4 讨论
RCC是一种转移性、异质性疾病，预后较差，对化疗不敏感，容易产生抗药性[31,32-36]。手术切除RCC只适合少数早期肿瘤患者[31,37,38] ，而且据报道三分之一的患者行部分病灶切除后出现复发[39]。转移性肿瘤患者的中位生存率为9~13个月[40]。对于转移性RCC患者，治疗过程中的耐药性仍然是一个主要挑战。因此，迫切需要更有效的RCC治疗方法。近些年来，基因靶向治疗RCC成为一种新的策略，已有一些研究探讨了RCC的治疗新靶点[38,41]。
我们通过TCGA数据库分析发现，PBRM1在ccRCC中的突变率高达41%，大多数为截短突变。它是ccRCC中的第二大突变基因，编码BAF180/PB1蛋白[42]。目前报道PBRM1可使肾细胞癌细胞黏附、碳水化合物代谢、凋亡过程和缺氧反应相关的基因表达上调，以及部分参与细胞分裂不同阶段的基因表达下调[43,44]，在VHL基因缺失的ccRCC细胞中，PBRM1失活可降低干扰素刺激基因因子3(ISGF3)的表达，影响干扰素的生成[45,46]。并且，PBRM1的缺失还与ccRCC患者预后较差相关[47]。结合我们的实验数据表明PBRM1在ccRCC中确实是一个抑癌基因。
LMNA基因编码的Lamin A/C是V型中间纤维，是核纤层蛋白质主要成分，可在核膜内侧与其他核纤层成分形成丝状网状结构，即核纤层结构。部分Lamin A/C也可分布于核基质中，Lamin A/C不仅参与核膜正常结构和功能的维持，还参与染色质高级结构的组织和基因的转录调控[48]。它在许多肿瘤中都存在着拷贝数的增加，因此在多数肿瘤中扮演着癌基因的角色。此外我们前期的实验结果表明，LMNA基因在部分ccRCC中也表现出拷贝数的增加，并且其在ccRCC细胞中有着部分和PBRM1基因相反的调控作用，基于此现象我们验证了PBRM1与LMNA之间可能存在着相互作用。
5 结论
（1）敲减ccRCC细胞中的PBRM1基因可以促进ccR CC细胞的增殖和迁移，PBRM1在ccRCC中发挥着抑癌基因的作用；
（2）敲减ccRCC细胞中的PBRM1基因结合低氧条件可以增加ccR CC细胞中糖酵解相关代谢酶基因mRNA及其蛋白的表达，同时还可以激活ccRCC细胞中的AKT/mTOR通路；
（3）在敲减ccRCC细胞中的PBRM1基因和低氧条件的协同作用下可以增加HIF1α的表达和细胞内的乳酸形成；
（4）ccRCC细胞中PB1蛋白可与Lamin A/C蛋白相互作用，可能进一步影响ccRCC细胞中AKT/mTOR通路活性。
参考文献（略）