本文是一篇医学论文，本研究对患者进行基因筛查有助于扩充HCM疾病突变谱，有利于基因型与表型关系理解，有助于法医对猝死案件提供客观公正的证据，有利于明确不明原因猝死者的死亡原因，对法医病理学实践具有重要意义。
研究对象与方法
1.研究对象
1.1实验组研究对象
本研究实验组收集2018年-2019年就诊于青岛大学附属医院14名无亲缘关系的HCM先证者为研究对象，其中男性11人，女性3人，对先证者进行全外显子组基因测序和目标序列捕获高通量测序，对家庭成员及健康对照组进行Sanger测序验证。
1.2诊断及排除标准
1.2.1诊断标准
根据2014年欧洲心脏病学会标准：①通过病史及家族史调查，没有发现导致心脏负荷增加的其他系统的疾病；②超声心电图或心脏核磁共振成像显示左室壁最大厚度≥15mm；③若患者存在HCM家族史，则左室壁最大厚度≥13mm。
1.2.2排除标准
①患者患有导致心脏负荷增强的心血管系统或其他系统疾病，例如慢阻肺、心瓣膜病、先天性心脏病及高血压等；②心尖肥厚型心肌病。
1.3对照组研究对象
对照组为307名心电图和超声心动图检查未见异常的健康志愿者，且不存在其他导致心脏负荷增大的疾病，各志愿者之间无亲缘关系。
1.3.1对照组入选标准
体检证实无心血管及其他系统性疾病史，心电图及超声心动图显示无心律失常及心肌肥厚和心脏结构性病变。
本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准后进行，并符合《赫尔辛基宣言》原则，所有参与基因筛查者均签订书面《知情同意书》。
4.实验方法步骤
4.1全外显子测序
与北京诺禾致源科技股份有限公司合作，对HCM先证者进行全外显子组基因测序。具体步骤如下：
4.1.1血液DNA基因组提取
①将血液放入4摄氏度冰箱保存，取出后融化摇匀，在离心管中加入1ml血液并加入1ml细胞裂解液，混匀；
②在转速12000rpm下离心10分钟，室温25摄氏度，弃去上清液；
③将浓度为20mg/mL蛋白酶K50μl、900μl细胞核裂解液以及浓度为10%的SDS50μl加入到全血中,混匀；
④将混合液放入恒温混匀器中，时间为60分钟；
⑤冷却后，加入1ml酚或氯仿，颠倒混匀5-6次至可见白色乳滴状物出现；
⑥继续室温下离心10分钟，转速12000rpm，将上清液吸取到新的离心管中，并加入预冷的异丙醇和10%的3M醋酸钠，混匀后放在零下20摄氏度冰箱中过夜；
⑦次日，在12000rpm转速下离心，在白色DNA沉淀中加入750μl75%乙醇；
⑧室温12000rpm转速离心10分钟后，弃掉上清，吸出乙醇，将DNA沉淀晾干后溶于适量TE缓冲液中。
研究结果
1. 基因测序结果
基因测序结果显示，14名先证者中有11名携带基因突变，共17个突变位点，其中MYH7基因8个（47%）、MYBPC3基因4个（23.5%）、TNNT2基因3个（17.6%）、MYL3基因1个（5.9%）、TPM1基因1个（5.9%），均为错义突变， MYHY-Arg143Gln突变在02号和08号先证者中同时检测到，TNNT2-K260R突变在04号、10号和11号先证者中同时检测到，共14种突变。多个突变位点携带者有4人（28.6%），分别为08-11号先证者（MYH7/ MYBPC3、MYH7/ MYL3、MYBPC3/ MYBPC3/ TNNT2、MYH7/MYBPC3/ TNNT2杂合突变）；单基因突变携带者有7人（50%）；3人（21.4%）不携带基因突变。其中TPM1-Ile154Val和MYBPC3-Tyr1251Ser为新发突变，其余12种基因突变为已知突变。对照组中307名志愿者不携带任何基因突变。具体突变情况如下（表1）：
2. 基因型-表型关系
结果显示，11名基因突变携带者中9名为男性（81%），2名为女性（19%），发病年龄最小为12岁，最大37岁，携带者平均发病年龄为26岁，曾发生过晕厥的患者有8例，其余患者临床症状严重程度不一，携带基因突变患者的情况具体如下（表2）：
①01号先证者为单基因突变携带者，其携带MYH7基因c.746G＞A（Arg249Gln）突变，该突变位于9号外显子，使MYH7基因编码的第249位氨基酸由精氨酸突变为谷氨酰胺，其在dbSNP数据库中的标识码为rs3218713，该突变位于MYH7基因头部，是肌球蛋白重要的功能区域，提示该突变为恶性突变。先证者34岁发病，表现为活动后呼吸困难、晕厥胸闷等，存在HCM及SCD家族史；超声显示梗阻性心肌肥厚（图1），室间隔厚14mm，SAM征阳性。患者接受Sanger测序（图2）的家庭成员有14名，其中发现3人携带该突变（II-11、III-2、III-11，图3），2人确诊为HCM（II-11、III-11），另一携带者诊断为心肌致密化不全（III-2），三名携带者临床症状较严重，均有晕厥史。
研究结果 ................................ 17
1.基因测序结果 ............................ 17
2. 基因型-表型关系 ................................. 17
3. 基因的生物信息学、保守性等分析 .................... 27
讨论 ................................. 31
结论 .................................. 38
讨论
肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是最常见的由基因突变导致的原发性心肌病[17,18]，其遗传方式是常染色体显性遗传[7,19]，偶尔也可见到常染色体隐性遗传报道，具有不完全外显率和多变表型。HCM主要特征是不明原因的心肌肥厚，常见形态有对称型或不对称型左室肥厚，心尖肥厚型心肌病较少见[20]。诊断难点主要是排除其他潜在的导致心肌肥厚的疾病，例如Fabry病、高血压和线粒体心肌病等，同时也应与运动员生理性心肌肥厚进行区分[12]。SAM征是非常重要的指标，它是HCM中左室流出道阻塞最常见的原因，与房颤、中风和SCD风险增加有关[21,22]，本研究中01、02、08和09号先证者SAM征阳性，发生SCD风险较高，应长期跟踪随访。HCM临床表型具有明显异质性，患者有时可以存在很严重的心脏表型，但表现为无症状或轻微症状，这种轻微症状并不代表是一种低风险状态。早年间HCM年SCD率可达4%以上[23]，但随着HCM危险分层和预防模式建立，尤其是预防性植入式心律转复除颤器（ICD）的使用，HCM患者的猝死率逐年降低。一项对474名7至29岁HCM患者的研究表明，SCD年发生率仅为0.54%[24]。另一对744名HCM患者的大型研究中，44名患者在8年内发生了SCD，SCD年发生率为0.7%[25]。也有人指出HCM是一种相对良性的疾病，大约有三分之二的患者能够达到正常寿命，且没有明显症状，尤其是左室流出道梗阻不严重的HCM患者[26,27]。SCD可能是HCM患者第一个临床表现，也可能是其最后一个临床表现，但无疑是最严重的症状，常常发生在无症状患者中[28]。这类无症状猝死者在尸检时要着重对心脏进行解剖，并且进行法医分子解剖，检测HCM致病基因，这样能准确的对这类猝死者做出死亡原因鉴定，确认或排除HCM，对遗传性心脏病的鉴定有重要意义。因此，对患者进行早期诊断、早期干预、避免猝死有一定帮助，对临床及法医学有重要影响，值得注意的是，有些SCD案例中，血液DNA会出现严重降解，然而经福尔马林固定过的组织和石蜡包埋的组织可以提供相对完整的基因组DNA，从尸检中获得高质量的基因组DNA是二代测序技术和心脏遗传学分析的前提。分子解剖又称死后基因检测，这项技术不仅可以解决HCM分子遗传学难题，也可促进法医病理学分子解剖的发展，将为我国猝死案件死因分析提供大数据支持。
结论
发现TPM1-Ile154Val和MYBPC3-Tyr1251Ser错义突变为新发突变，在正常人群中不存在，国内外均未见报道。验证了MYH7-Arg249Gln和MYH7-Arg143Gln基因突变可引起HCM，携带者表型与报道相符。对患者进行基因筛查有助于扩充HCM疾病突变谱，有利于基因型与表型关系理解，有助于法医对猝死案件提供客观公正的证据，有利于明确不明原因猝死者的死亡原因，对法医病理学实践具有重要意义。
参考文献 （略）