本文是一篇医学论文，本试验将分离于绵羊肺炎的ExP EC XJ10和cyaA基因缺失株感染MH-S，收集细胞进行转录组学和蛋白质组学测定，系统分析绵羊肺源ExPEC XJ10的AC在呼吸系统感染中对MH-S的作用，为阐明绵羊肺源E.coli感染机制提供有意义数据。
第一章绪论
1.1研究的目的与意义
大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）是人和动物肠道中的正常菌群，可以获得含有编码毒力因子的可移动遗传元件，从而导致广泛的肠道和肠外疾病。E.coli因其感染宿主部位不同可以分为肠道致病性E.coli和肠外致病性E.coli（Extraintestinal pathogenicEscherichia coli，ExPEC）。ExPEC具有复杂的系统发育分群结构、广泛的毒力因子和相当大的基因组可塑性，可以导致宿主发生新生儿脑膜炎、泌尿系统感染、败血症和肺炎。
腺苷酸环化酶（Adenylate Cyclase，AC）由cyaA基因编码，其催化ATP形成cA MP。cA MP是E.coli的第二信使，在调节生物膜形成、III型分泌系统、碳代谢等方面发挥着重要作用。cA MP的下游调控作用是通过其与cA MP受体蛋白（cA MP receptor protein，CRP）结合后形成CRP-cAMP复合体介导的，调控E.coli近50%的基因的转录水平。
位于肺泡腔表面的肺泡巨噬细胞（Pulmonary alveolar macrophages，PAMs）是肺内数量丰富的天然免疫细胞，是最先接触到病原体微生物和污染物的免疫防御细胞之一，主要是通过模式识别受体识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式，从而发生炎症的级联放大反应，协调肺部免疫反应，维持机体稳态功能。
核糖核酸（RNA）是细胞和生物体中一类重要的生物分子，RNA有多种类型，每一种都在基因表达中发挥重要作用，并最终将基因型与表型连接起来。蛋白质组包含细胞或机体翻译及修饰后的全部蛋白质。蛋白质组学可以确定样品中存在的蛋白质，并量化在各种病理条件下蛋白质表达量的变化。转录组学和蛋白质组学的联合分析能更直观的了解病原微生物在入侵宿主细胞过程中的生理和病理变化。
1.2致病性大肠杆菌研究进展
1.2.1大肠杆菌生长特性
E.coli是变形菌门肠杆菌科的革兰阴性菌，形态两端钝圆，大小约为1μm-3μm×0.5μm-0.7μm。大多数菌株有荚膜、鞭毛、菌毛结构。E.coli在不同培养基上有不同培养特性：在LB琼脂平板上呈圆形白色菌落，在麦康凯琼脂平板上呈圆形红色菌落，在伊红美蓝琼脂平板上呈带金属光泽的黑色菌落，一些致病菌株在血琼脂平板上呈β溶血[1]。
E.coli对营养需求能力较低，可以分解如葡萄糖、果糖和麦芽糖等大部分糖类，代谢合成能力较高。在适宜环境中，E.coli发酵速度偏快，可以在侵入宿主细胞后大量繁殖使宿主致病。E.coli最佳生长温度为37℃，抗热能力强于其他肠杆菌科的细菌，在低温的环境中能存活更久[2]。
1.2.2E.coli系统进化分群和多位点序列分析
自1885年Theodor Escherich发现E.coli以来，E.coli已成为实验室研究的最易处理的模式生物之一。许多实验室对研究使用的E.coli菌株进行比较和分析研究，超过3600个基因组已经部分或全部测序，简化了E.coli的复杂性和多样性。揭示了七个主要的系统进化分群：A、B1、B2、C、D、E和F，其余未分类的亚型被归入第八个群（Escherichia Cryptic Clade），具体系统进化分群结果如表1[3,4]。chuA、yjaA、TspE4.C2和arpA是E.coli系统进化分群中重要的标记基因。chuA基因编码的外膜蛋白血红素能帮助细菌入侵宿主细胞；yjaA基因编码的应激蛋白在对外界刺激反应中发挥作用；TspE4.C2基因编码的脂肪酶酯酶是在E.coli基因组中发现的特定序列；arpA作为靶标基因使新方法成为四重PCR，能更好的对细菌进行系统进化分群[5]。研究发现胃肠道内无致病性的共生型E.coli大多数属于A群或B1群，引起肠道感染的致病性E.coli大多数属于A群、B1群或D群，引起肠外感染的E.coli大多属于B2群和D群，E.coli的克隆菌株，具有遗传多样性，但表型无法区分，被划分到Cryptic Clade I[6,7]。
第二章cyaA基因缺失对绵羊肺源大肠杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞的影响
2.1前言
肠外致病性大肠杆菌（ExPEC）是人畜共患病的重要病原，其中大量毒力因子是决定致病力的关键因素，如粘附素、菌毛、脂多糖、毒素等。这些毒力因子通常由某些致病岛、质粒和其他一些可移动遗传元件编码[35,36]。cyaA是某些细菌基因组中具有调节毒力功能的最重要基因之一，其编码的AC是一类与细菌毒力密切相关的毒力因子，在细菌对碳源及氨基酸的摄取和利用、对能源的代谢及分解、合成菌毛和鞭毛等生理功能上具有调控作用[60]。肺泡巨噬细胞（PAMs）是肺泡最早接触病原微生物的免疫细胞之一，其识别病原后，通过Toll样受体、病原体相关分子模式和危险相关分子模式激活免疫应答，从而发生炎症的级联放大反应，协调肺部免疫反应，维持机体稳态功能[86]。
新疆作为养羊重要省份，近年来羊呼吸道感染疾病发生频繁，作者所在实验室从发生肺炎的绵羊肺脏组织中分离到多株大肠杆菌并检测到cyaA基因，发现缺失该基因的菌株毒力明显下降[55]。但对小鼠肺泡巨噬细胞MH-S的粘附能力、侵袭能力和细胞损伤的影响并不明确。本研究在前期研究基础上检测并分析缺失cyaA基因XJ10的粘附侵袭相关基因mRNA表达量的变化、对小鼠MH-S的形态影响、在不同时间段的粘附、侵袭细胞的变化以及对细胞增殖抑制率和细胞凋亡率的影响，为绵羊肺源ExPEC的致病机制的进一步研究奠定基础。
2.2材料
2.2.1细胞和菌株
绵羊肺源ExPEC XJ10野毒株由新疆农垦科学院畜牧兽医研究所和石河子大学动物科技学院预防兽医学实验室分离，cyaA基因缺失株（XJ10ΔcyaA）也由该单位构建；小鼠肺泡巨噬细胞（MH-S）购自无锡欣润生物科技有限公司。
2.2.2主要试剂
本试验主要试剂见表2-1。
第三章绵羊肺源ExPEC XJ10 cyaA基因缺失对感染MH-S细胞的转录组学的影响....24
3.1前言................................24
3.2材料..................................24
第四章绵羊肺源ExPEC XJ10 cyaA基因缺失对感染MH-S细胞的蛋白质组学的影响..............38
4.1前言...................................38
4.2材料...........................................38
第五章全文总结................................56
第四章绵羊肺源ExPEC XJ10 cyaA基因缺失对感染MH-S细胞的蛋白质组学的影响
4.1前言
蛋白质组学是是功能基因组学的重要组成部分，可以从细胞内蛋白组成、蛋白结构及蛋白表达量进行研究。生物体的基因组是恒定的，基因组在转录后还有翻译、翻译后加工及修饰等过程，而这些过程在细胞与细胞之间，细胞的不同时间点之间是有差异的，当蛋白质表达量达到峰值时mRNA可能已经降解，或当mRNA表达量到达峰值时，蛋白质还在翻译中，因此基因转录变化及其翻译变化没有必然联系，而蛋白质组学能在细胞水平上反映宿主细胞在感染细菌后某个时间段所有蛋白的表达及修饰情况[79,80]。
前期通过对感染了XJ10ΔcyaA的MH-S细胞进行转录组学测序发现cyaA基因编码的腺苷酸环化酶在E.coli感染宿主过程中能通过某些通路抑制宿主细胞的炎性反应，只是从细胞的转录水平获取了部分数据，其在蛋白质翻译水平方面的变化尚不清楚。本研究通过TMT蛋白质组学技术，对感染了XJ10野毒株和XJ10ΔcyaA的MH-S细胞进行蛋白质组测序，并对获得的测序数据进行生物信息学分析，结合第三章的转录组学进行联合分析，更好的阐述腺苷酸环化酶在E.coli感染中的作用。
第五章全文总结
（1）cyaA基因缺失导致XJ10的粘附侵袭相关基因转录水平下调，对MH-S细胞的粘附侵袭能力下降，对细胞损伤能力及诱导细胞凋亡下降。
（2）转录组学分析发现，在XJ10感染MH-S细胞过程中，cyaA基因主要影响细胞的免疫反应、急性炎性反应等相关基因的表达，影响JAK-STAT和NF-κB信号通路等相关通路的调控。
（3）蛋白组学分析发现，在XJ10感染MH-S细胞过程中，cyaA基因主要影响细胞的信号转导、细胞凋亡、炎性反应等相关蛋白的表达，影响NF-κB信号通路等相关通路的调控。
（4）转录组和蛋白组学关联分析发现，在XJ10感染MH-S细胞过程中，KEGG主要富集到NF-κB信号通路，筛选到Bcl2a1和Il1b两个显著上调的数据。
参考文献（略）