第一章氧化应激及相关蛋白研究背景
1.1氧化应激
ROS极易对构成细胞的生物分子进行氧化性的修饰，从而对机体造成氧化性损伤。因此，当机体的氧化与抗氧化间的平衡遭到破坏，使得该平衡向着氧化状态偏移，机体产生大量的高活性分子如ROS，当产生的ROS过多超过机体的清除能力；或机体的抗氧化能力有所下降，ROS的清除不足，使得体内积累了过多的ROS时，ROS会对构成组织的生物大分子进行破坏性的修饰，从而引起组织细胞氧化性损伤，该过程称为氧化应激（Oxidative Stress, OS)。OS具有双重性。一方面，生理状态的ROS有刺激细胞生长的作用。当病原体侵入动物机体后，OS大量产生的ROS可以帮助吞唾细胞杀死病原体，同样的，肿瘤放疗过程中福射易引起0S，这时候的OS可促进肿瘤细胞的消亡;另一方面，OS中过量的ROS会对许多重要的细胞组成成分进行结构上的修饰，这将严重威胁到细胞正常的生理功能，如ROS对不饱和脂肪酸进行氧化或过氧化，而生物膜的流动性主要是由不饱和脂肪酸提供，这一结构修饰会使膜的流动性降低，营养吸收能力下降等。
1.2与氧化应激相关的疾病
绝大多数情况下，OS对人体是有害的，甚至会引起许多重大的疾病[2，3](图1.1)，如动脉粥样硬化、糖尿病、心力衰竭、癌症、牙周炎、中风、帕金森氏病和阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD)等，而且ROS还被认为是导致衰老的主要原因。下面我们就几种由OS引起的疾病作一些简单介绍。
1.2.1氧化应激与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化是危害人类健康的最严重的心血管系统疾病中的一种，大多数的心血管系统疾病是由复杂的动脉粥样硬化引起的。动脉粥样硬化是一个复杂的过程，包括血衆脂蛋白沉淀过程和动脉管壁细胞元素的增殖过程。动脉粥样硬化形成的起始阶段首先是氧化态的低密度脂蛋白（oxidized low-densitylipoprotein, Ox-LDL)通过受损的内皮细胞进入到动脉管壁[4’5](图1.2)，进入内皮细胞下的Ox-LDL会诱导一些复原细胞和刺激平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs)增殖的因子释放，同时也可以诱发黏附分子如P选择素（P-selectin [6])、血管點附分子-1 (VCAM-1)、趋化性因子如单核白细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractantprotein-1, MCP-1)和巨唆细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor,mCSF)等的表达[7，8]，其中，點附分子有利于白细胞与内皮细胞的结合。高水平的Ox-LDL也会导致内皮一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的下调，从而抑制内皮细胞分泌血管舒张因子一氧化氮（NO)。大量點附分子的合成与释放导致单核细胞和T-淋巴细胞聚集、被激活并吸附在内皮细胞上[9]。然后，内皮细胞、白血球和SMCs分泌生长因子（growth factor)和化学引诱物。单核细胞摄取脂蛋白分化成为巨暖细胞，巨唾细胞产生ROS，ROS将促进血管收缩因子内皮素（ET)的合成与释放，并将Ox-LDL转化为氧化性更高的LDL。紧接着巨嗟细胞吞唾LDL形成泡沫细胞。泡沫细胞与白细胞结合形成脂肪纹（fatty streak)。泡沫细胞持续不间断地分泌生长因子使SMCs迁移进入内膜。SMCs不断的增殖和迁移、单核细胞和巨唆细胞不断的聚集使脂肪纹逐步演变为严重的组织损伤，并最终形成纤维斑块凸出到动脉血管腔。然后，由于興化和持续的纤维化，纤维斑块形成一个包裹富含脂质内核的帽状纤维结构。当纤维斑块破裂时，动脉血栓就形成了。
第二章Erol的结构与功能关系及抑制剂发现研究
2.1引言
很多胞外蛋白在分泌前需经历一个分子内或分子间二硫键形成的过程，称为翻译后修饰，这些二硫键的形成可以帮助蛋白质获得正确的三级结构。蛋白质错误折叠会导致许多重要疾病，如糖尿病，关节炎，癌症，心血管系统疾病以及神经退行性疾病等那么二硫键形成的机制是怎样的呢？真核细胞中，二硫键形成的主要途径是从内质网开始的，主要是由两组蛋白质协同作用的结果。这两组蛋白分别是硫氧还蛋白家族的可溶性蛋白质二硫键氧化还原酶和膜相关的黄素蛋白内质网氧化还原酶-l(Erol)[65?67，69，7G]。它们都利用琉基一二硫键交换机制将二硫键从自身传递到底物蛋白[68，121.124]。Erol可以选择性地氧化细胞内PDI，通过氧化PDI活性位点的CXXC基序[65]促进了内质网（ER)中二硫键的形成。被Erol氧化后的PDI接下来可以直接氧化分泌蛋白。对能促使二硫键形成的酶的二硫键形成机制的研究源于对FAD依赖型氧化酶Erv/ALR蛋白家族和QSOX家族的研究。这两个蛋白家族氧化二硫键形成多遵循着如(2-1)反应[76，78]。Erv/ALR模块本身可以是一个单结构域的蛋白，也可以像在QSOX酶中一样与硫氧化还原类蛋白结构域融合于同一个蛋白[125]。Erv/ALR模块在不同亚细胞间隙或特定氧化反应的多种蛋白中均有发现。Erv2p是这个家族中的一员，它le留在酵母菌内质网中，在该间室中生成一小部分的二硫键。
第三章QSOX中CXXC基序对底物巯基.......... 37
3.1 背景介绍.......... 37
3.2实验方法 .......... 37
3.3 结果与讨论.......... 40
3.4本章小结.......... 48
第四章Sr-Rex的同源模建和分子动力学.......... 50
4.1 背景介绍 ..........50
4.1.1 Rex 的结构.......... 50
4.1.2 Rex的研究意义和设计思路.......... 52
4.2研究方法 ..........53
4.3结果与讨论.......... 56
4.4本章小结 .......... 71
第五章新型环氧水解酶催化缩水甘油醚.......... 72
5.1 背景介绍 ..........72
5.2实验方法 .......... 76
5.3 结果与讨论 .......... 77
5.3.1 同源模建.......... 77
5.3.2 BMEH 的结构.......... 79
5.3.3结合模式 .......... 79
5.4 本章小结.......... 83
结论
机体在进行有氧呼吸、氧化还原等生理过程中会产生活性氧簇，活性氧簇积累到一定程度则会引起氧化应激。氧化应激是机体普遍存在的现象。研究发现许多疾病与氧化应激相关。糖尿病、动脉粥样硬化、帕金森氏病等几类严重危害人类健康的疾病都与氧化应激存在或多或少的联系。了解生物系统中每一个氧化还原元素的生物动力学在氧化还原信号和氧化应激研究领域是一个巨大的挑战。在这里，我们通过计算机模拟的方法对几类重要的氧化还原酶Erola、Erolp、QSOX以及Rex进行了结构与功能关系的研究。计算机辅助药物分子设计是在计算机的帮助下，对生物大分子或小分子进行计算模拟，预测蛋白质特征、小分子ADMET、或蛋白质与配体的相互作用模式。在过去的几十年中，计算机辅助药物设计在药物设计中发挥了重要的作用。在本研究中我们将计算机模拟技术与生物实验相结合对多个重要勒标的结构、功能和分子调控进行了研究。通过同源模建首次构建了 Erola、QSOX的TRX1结构域，Sr-Rex的同源二聚体以及环氧水解酶的三维结构，为进一步的生物功能研究奠定了基础。通过构建Erola的三维结构模型，观察其结构特点，我们发现其稳定性不如Erolp，根据其催化特点，我们提出其最佳PH值为碱性，这两点都通过生物实验得到了验证。另外，我们通过结合位点预测初步认为FAD结合口袋即为Erola的底物结合口袋，并对其口袋特征进行了详细地讨论。之后，在不知道Erolp底物结合位点，并且没有已知活性化合物作为参考的情况下，我们在对Erola研究基础上，选择Erolp的FAD结合位点为对接口袋对Erolp进行了基于对接的虚拟蹄选工作。筛选结果非常理想，我们获得了 12个对Erolp有抑制活性的小分子化合物，其中3个对Erolp和Erola有选择性抑制活性。而化合物1，2，3的结构和结合模式与后来发表的Erol的活性化合物EN460的非常相近，这间接地证明了我们的蹄选是合理的。更加肯定了 FAD结合口袋是一个底物结合口袋的推测。QSOX的三维结构非常独特，其全长结构至今仍不可得，并且PDB库中没有任何一个晶体结构与其同源。为了调查其三个CXXC基序在催化不同底物时的生物学功能，我们从结构同源性出发，选择PDI催化活性的a’结构域为模板构建了 QSOX的TRX1结构域的三维结构模型。从QSOX与底物的结合模式上解释了三个基序不同的催化角色。Rex由于其重要的生物学功能，成为一个炎手可热的研究祀标。为了研究一个全新的蛋白Sr-Rex的生物学功能，在进行盲目的突变实验之前，我们对其进行了同源模建和分子动力学模拟。我们深入地比较了 Sr-Rex与NADH/NAD+的结合差异。研究Sr-Rex与ROP的结合模式，找到了其中起关键作用氨基酸残基，Arg23、Arg71以及Lys57等。通过分子动力学模拟，可以指导生物实验，减少实验的盲目性。
参考文献
1. R. B. Petersen, A. Nunomura, H. G. Lee, G. Casadesus, G. Perry, M. A. Smith，and X.Zhu. Signal transduction cascades associated with oxidative stress in Alzheimer'sdisease. J Alzheimers Dis. 2007, 11(2): 143-152
2. M. B. Grisham, D. N. Granger, and D. J. Lefer. Modulation of leukocyte-endothelialinteractions by reactive metabolites of oxygen and nitrogen: relevance to ischemic heartdisease. Free Radic Biol Med. 1998，25(4-5): 404-433
3. D. Tang, R. Kang, H. J. Zeh, 3rd, and M. T. Lotze. High-mobility group box 1,oxidative stress, and disease. Antioxid Redox Signal. 2011, 14(7): 1315-1335
4. N. R. Madamanchi, A. Vendrov, and M. S. Runge. Oxidative stress and vascular disease.Arterioscler Thromb Vase Bioh 2005, 25(1): 29-38
5. M. Navab，J. A. Berliner, A. D. Watson, S. Y. Hama, M. C. Territo, A. J. Lusis, D. M.Shih，B. J. Van Lenten, J. S. Frank, L. L. Demer, P. A. Edwards, and A. M. Fogelman.The Yin and Yang of oxidation in the development of the fatty streak. A review basedon the 1994 George Lyman Duff Memorial Lecture. Arterioscler Thromb Vase Biol.1996，16(7): 831-842
6. D. K. Vora，Z. T. Fang, S. M. Liva, T. R. Tyner, F. Parhami, A. D. Watson, T. A. Drake,M. C. Territo, and J. A. Berliner. Induction of P-selectin by oxidized lipoproteins.Separate effects on synthesis and surface expression. Circ Res. 1997，80(6): 810-818
7. S. D. Gushing, J. A. Berliner, A. J. Valente, M. C. Territo, M. Navab, F. Parhami, R.Gerrity，C. J. Schwartz, and A. M. Fogelman. Minimally modified low densitylipoprotein induces monocyte chemotactic protein 1 in human endothelial cells andsmooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1990，87(13): 5134-5138
8. T. B. Rajavashisth，A. Andalibi，M. C. Territo，J. A. Berliner, M. Navab, A. M.Fogelman，and A. J. Lusis. Induction of endothelial cell expression of granulocyte andmacrophage colony-stimulating factors by modified low-density lipoproteins. Nature.1990，344(6263): 254-257
9. R. P. McEver. Leukocyte-endothelial cell interactions. Curr Opin Cell Biol. 1992, 4(5);840-849
10. D. Pratico. Evidence of oxidative stress in Alzheimer's disease brain and antioxidanttherapy: lights and shadows. Ann N Y Acad Sci. 2008, 1147: 70-78